Université de REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE UFR Médecine
Ecole Doctorale Science Technologie Santé
THÈSE
Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne
Discipline : Biochimie et Biologie Moléculaire
Par
Jézabel FERU
Le 9 décembre 2013
Etude de la diminution du collagène IV au cours du vieillissement cutané et des mécanismes impliqués
Directeur de thèse Sylvie BRASSART-PASCO
Membres du Jury
Président du jury: Monsieur le Professeur François-Xavier MAQUART
Rapporteurs : Madame le Docteur Patricia ROUSSELLE
Monsieur le Docteur Bernard COULOMB
Examinateurs : Madame le Docteur Christine JEANMAIRE
Monsieur le Docteur Olivier PIOT
Directeur de thèse : Madame le Docteur Sylvie BRASSART-PASCO
N° attribué par la bibliothèque :
| | | R | E | I | | | | | |
A la mémoire de mon père,
A ma mère,
Remerciements
Avant tout, je tiens à remercier Monsieur le Professeur François-Xavier
Maquart, directeur du laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie
Moléculaire, FRE CNRS 3481, de m’avoir accueillie au sein de son laboratoire
et de m’avoir permis de réaliser ce travail dans les meilleures conditions.
Ensuite, je tiens à exprimer mes sincères remerciements au Docteur Sylvie
Brassart-Pasco pour avoir dirigé cette thèse et pour m’avoir formée depuis
mon master 2. Merci pour tes conseils, ton encadrement et ton aide lors de la
rédaction de ce manuscrit. Je n’aurais pu espérer meilleure directrice de
thèse.
J’adresse mes plus vifs remerciements aux Dr. Patricia Rousselle et Dr
Bernard Coulomb pour avoir accepté de juger ce travail en qualité de
rapporteurs, ainsi que les Dr Christine Jeanmaire, Dr Olivier Piot et Pr
François-Xavier Maquart pour avoir accepté d’être examinateurs.
Je remercie le Docteur Christine Terryn pour son aide précieuse lors de mes
analyses d’images et pour m’avoir formée et guidée sur le microscope
confocale.
Je remercie également les Docteurs Olivier Piot et T.T Nguyen pour les
études en spectroscopie Raman.
Un grand merci au Dr Sandrine KURDIKOWSKI pour m’avoir formée à
travailler sur les explants de peau.
Je remercie toutes les personnes ayant partagé, de façon plus ou moins
longue, mon bureau : Karine et Aïda, mes premiers repères au sein du labo et
qui m’ont énormément manqué après leur départ. Emilie avec qui j’adorais
discuter de tout et de rien. Alexia et Melissa les Master 1 avec qui j’ai adoré
avoir des discussions « girly » et mettre des fonds d’écran « Barbie ». Mélissa
tu vas reprendre à la perfection mon rôle de « Miss boulettes » (Pauvre
Bertrand ).
Bertrand avec ses blagues, la bonne humeur qu’il instaure dans le bureau,
ses magnums (humm) mais aussi ses conseils scientifiques et la relecture du
manuscrit.
Je remercie les techniciennes Coco et Aurélie, pour leur grande patiente face
à toutes mes questions et surtout parce qu’elles participent grandement à la
bonne ambiance qui règne au sein du laboratoire.
Une pensée pour les « disparues » : Claire, ma copine de « True blood » ainsi
que Caro et Julia. J’ai bien rigolé avec vous !!
Plus généralement, je voudrais remercier toutes les personnes qui ont
partagé mon quotidien au laboratoire : Catherine, Isabelle, Christelle ...
Marlène j’aurais aimé te connaitre avant, j’aime beaucoup discuter avec toi.
Laetitia bon courage pour ta dernière année mais je ne m’inquiètes pas pour
toi tu assures trop. Kashia qui a démarré et terminé cette aventure avec
moi : plein de bonne choses pour la suite !
Karim, merci pour nos discussions … ça me manquera !
Pour les remerciements plus personnels :
A ma famille en général, car c’est ce qui compte le plus dans la vie,
Puis plus particulièrement à ma maman, je n’ai pas de mots pour exprimer
ce que je ressens pour toi et pour te remercier comme tu le mérites ! Pour
tout ce que tu fais pour moi depuis toujours et pour être mon pilier le plus
solide ! Cette thèse est aussi la tienne !
Toutes mes pensées vont vers mon père, mon ange gardien … tu me manques
encore plus cruellement en cette période ! J’ai démarré toute cette aventure
pour toi …JE L’AI FAIT PAPA !!
Je remercie Beau papa pour son rôle de second père et pour s’occuper si bien
de moi depuis que je suis toute petite.
Merci à mes deux meilleures amies : Laetitia ma sœur de cœur avec qui j’ai
passé une adolescence de rêve pleine de fou rires , et Lucie pour avoir été la
dans des moments très durs et les avoir transformés en souvenirs
mémorables ! je vous aime les filles !
Et puisque (presque) tout est permis dans cette partie de manuscrit, j’ai une
tendre pensée pour mes 3 bébés : Pokito, Socrate et Titoune !! Mes bebettes
d’amours qui m’apaisent et qui m’apportent leur amour inconditionnel.
Je finirais par toi Jordan et je ne dirais qu’une chose : tout commence
maintenant …
RESUME
Titre : Etude de la diminution du collagène IV au cours du vieillissement cutané et des mécanismes impliqués
Le vieillissement cutané s’accompagne d’altérations des composants de la matrice extracellulaire. Des études ont montré que le contenu en collagène IV diminuait dans la peau à partir de 35 ans. Le collagène IV, constituant majeur des membranes basales, est formé de l’association, en triple hélice, de 3 chaînes parmi 6 possibles: 1(IV) à 6(IV). Au niveau de la membrane basale cutanée, encore appelée jonction dermo-épidermique, seulement deux isoformes de collagène IV ont été mises en évidence : [1(IV)2; 2(IV)], isoforme majoritaire, et [5(IV)2; 6(IV)], isoforme minoritaire, synthétisées par les fibroblastes et les kératinocytes. Nous avons vérifié, par western-blot sur des extraits de peaux, cette diminution de collagène IV. Nous avons ensuite analysé la répartition du collagène IV au niveau de la JDE sur des coupes transversales de peau et n’avons pu mettre en évidence de discontinuité dans le réseau de collagène IV avec l’âge, du fait des fortes variations inter-individuelles. Parallèlement, sur coupe de peau, nous avons tenté de mettre en évidence des différences spectrales du collagène IV avec l’âge par spectroscopie Raman mais la résolution s’est avérée insuffisante. Nous avons isolé des fibroblastes de patients d’âges différents et montré une diminution de l’expression génique de la chaîne 1(IV) malgré de fortes variations inter-individuelles. Afin de s’affranchir de ces variations inter-individuelles pour étudier les mécanismes impliqués dans la diminution d’expression du collagène IV, nous avons mis au point un modèle de vieillissement accéléré de fibroblastes traités à l’H2O2 et vérifié le phénotype sénescent des cellules (morphologie modifiée, augmentation de l’activité SA--galactosidase, augmentation de p21WAF-1…). Nous nous sommes intéressé à la voie du TGF-1. Nous avons montré que l’expression du récepteur au TGF-1, TRII, diminuait dans le modèle de vieillissement accéléré. Nous avons également montré qu’un anticorps bloquant anti-TGF-1 reproduisait la diminution d’expression de collagène IV observée au cours de la sénescence. La détermination du mécanisme impliqué pourrait permettre, à terme, de proposer de nouvelles stratégies pour maintenir l’intégrité de la membrane basale lors du vieillissement cutané.
Mots clés : collagène de type IV, vieillissement cutanée, fibroblastes dermiques, sénescence, TGF-ß1
ABSTRACT
Title: Study of type IV collagen decrease during skin aging and involves mechanisms During aging skin there are extracellular matrix alterations. Preliminary studies showed that type IV collagen content decreased in skin with age after 35 years. Type IV collagen is a major component of basement membranes. It’s constituted by the association of 3 alpha chains among 6 possible (1 to 6). In the cutaneous basement membrane also called dermo-epidermal junction, only two isoform of type IV collagen were found: [1(IV)2; 2(IV)], which is majoritary isoform, and [5(IV)2; 6(IV)], which is minoritary, both synthesized by fibroblasts and keratinocytes. We checked the decrease in type IV collagen by western-blot on skin extracts. We then analyzed the distribution of this collagen in the DEJ on skin sections but we were not able to highlight a discontinuity in the network of type IV collagen during aging. At the same time, we tried to highlight spectral differences of the collagen IV with aging by Raman spectroscopy on skin sections but the resolution was insufficient. 35 years. We showed a decrease of type IV collagen expression by dermal fibroblasts in spite of strong variation between patients. In order to study the mechanism involved in type IV collagen variation during aging in dermal fibroblasts avoiding inter-individual variations, we develop an accelerated aging model of fibroblasts by treatment with H2O2. We checked the senescent phenotype of the cells (modified morphology, increase of SA--galactosidase activity, increase of p21WAF-1…). We were interested on the TGF-1 pathway and we showed that TGF-1 receptor, called TRII, was decreased in our accelerated aging model. We also showed that a blocking antibody against TGF-1 reproduced the decrease of type IV collagen expression observed during the senescence. The determination of the involved mechanism could lead to propose new strategies to maintain the integrity of the basal membrane during skin aging.
Keywords : IV collagen, skin aging, dermal fibroblasts, senescence, TGF-ß1
1
SOMMAIRE
SOMMAIRE ____________________________________________________________________________ 1
LISTE DES FIGURES ____________________________________________________________________ 7
LISTE DES TABLEAUX _________________________________________________________________ 12
LISTE DES ABBREVIATIONS ___________________________________________________________ 13
LISTE DES COMMUNICATIONS ________________________________________________________ 17
LISTE DES PUBLICATIONS _____________________________________________________________ 18
A.Introduction _________________________________________ 19
I Les collagènes ________________________________________________________ 21
I-1 Généralités _______________________________________________________ 21
I-2 Le collagène IV ____________________________________________________ 23
I-2-1 Organisation génique et régulation _______________________________________________ 23
I-2-2 Structure du collagène IV _______________________________________________________ 25
I-2-3 Mise en place du réseau de collagène IV __________________________________________ 27
I-2-4 Distribution tissulaire des chaînes (IV)____________________________________________ 28
I-2-5 Collagène IV et pathologies _____________________________________________________ 28
I-2-6 Collagène IV et vieillissement ____________________________________________________ 28
I-3 Régulation de la synthèse de collagène IV par le TGF- ____________________ 29
I-3-1 Le TGF- _____________________________________________________________________ 29
I-3-1-1 Généralités_______________________________________________________________ 29
I-3-1-2 Synthèse et sécrétion ______________________________________________________ 30
I-3-1-3 Activation du récepteur ____________________________________________________ 30
I-3-1-4 Voies de signalisation impliquées _____________________________________________ 31
I-3-1-4-1 La voie des Smads _____________________________________________________ 31
I-3-1-4-2 La voie des MAP kinases ________________________________________________ 32
I-3-1-4-3 La voie des PI3K/Akt ___________________________________________________ 33
I-3-2 Rôle dans la synthèse de collagène _______________________________________________ 34
I-3-2-1 Collagène I _______________________________________________________________ 34
I-3-2-2 Collagène IV ______________________________________________________________ 36
II.La peau _____________________________________________________________ 37
2
II-1 Fonctions physiologiques de la peau __________________________________ 37
II-1-1 Protection ___________________________________________________________________ 37
II-1-2 Détection des informations extérieures ___________________________________________ 38
II-1-3 Maintien de la température corporelle (thermorégulation) ___________________________ 38
II-2 Structure ________________________________________________________ 39
II-2-1 L’épiderme __________________________________________________________________ 39
II-2-1-1 La couche cornée (stratum corneum) _________________________________________ 40
II-2-1-2 La couche claire (stratum lucidum) ___________________________________________ 41
II-2-1-3 La couche granuleuse (stratum granulosum) ___________________________________ 41
II-2-1-4 La couche épineuse (stratum spinosum) _______________________________________ 41
II-2-1-5 La couche basale (stratum germinativum) _____________________________________ 42
II-2-1-6 Principales cellules de l’épiderme ____________________________________________ 42
II-2-2 Le derme ____________________________________________________________________ 42
II-2-2-1 Derme papillaire __________________________________________________________ 43
II-2-2-2 Derme réticulaire _________________________________________________________ 43
II-2-3 Hypoderme __________________________________________________________________ 44
II-3 Jonction dermo-épidermique ________________________________________ 44
II-3-1-Généralités __________________________________________________________________ 44
II-3-2 Structure ____________________________________________________________________ 45
II-3-3 Les principaux composants _____________________________________________________ 47
III. Le vieillissement cutané______________________________________________ 50
III-1 Vieillissement extrinsèque __________________________________________ 50
III-1-1 Influence du tabac et de la nicotine ______________________________________________ 50
III-1-2 Influence de l’exposition solaire _________________________________________________ 50
III-1-3 Influence de la pollution de l’air _________________________________________________ 52
III-2 Vieillissement intrinsèque __________________________________________ 52
III-2-1 Influence des facteurs génétiques _______________________________________________ 52
III-2-2 Influence des variations hormonales _____________________________________________ 52
III-2-3 Influence du stress oxydatif ____________________________________________________ 53
IV. La sénescence ____________________________________________________ 56
IV-1 Evolution du concept de sénescence _________________________________ 56
IV-2 la sénescence réplicative ___________________________________________ 57
IV-2-1 Phénotype sénescent _________________________________________________________ 58
IV-2-2 Morphologie cellulaire ________________________________________________________ 58
IV-2-3 La SA -gal (senescence associated beta-galactosidase) _____________________________ 59
IV-2-4 Délétion de l’ADN mitochondrial ________________________________________________ 60
IV-2-5 Les gènes associés à la sénescence ______________________________________________ 60
IV-2-6 Raccourcissement des télomères ________________________________________________ 62
3
IV-2-7 Arrêt irréversible du cycle cellulaire______________________________________________ 63
IV-2-8 Voies de signalisations impliquées _______________________________________________ 64
IV-2-9 Rôle de la sénescence dans le vieillissement _______________________________________ 67
IV-3 La sénescence accélérée induite par le stress ___________________________ 68
IV-3-1 Stress aïgu sublétal: sénescence accélérée induite par le stress oxydatif ________________ 68
IV-3-1-1 Voies de signalisation impliquées dans la sénescence accélérée induite par H202 _____ 69
IV-3-1-2 Expression des gènes associés à la sénescence par les fibroblastes dermiques humains
traités avec H202 ________________________________________________________________ 70
IV-3-2 Stress chronique sublétal: sénescence accélérée induite par le stress au NaCl ____________ 71
B. But de l’étude _______________________________________ 73
C. Matériel et Méthodes _________________________________ 75
I.Matériels et réactifs utilisés _____________________________________________ 76
II.Méthodes ___________________________________________________________ 83
II-1 Isolement et culture cellulaire _______________________________________ 82
II-2 Immunohistochimie _______________________________________________ 82
II-2-1 Coupes congelées _____________________________________________________________ 82
II-2-2 Coupes de peaux incluses en paraffine ____________________________________________ 83
II-3 Spectroscopie Raman sur coupes transversales de peau __________________ 84
II-3-1 Principe _____________________________________________________________________ 84
II-3-2 Analyse _____________________________________________________________________ 85
II-4 Obtention des différents modèles de vieillissement ______________________ 85
II-4-1 Modèle murin ________________________________________________________________ 85
II-4-1-1 Vieillissement naturel ______________________________________________________ 85
II-4-1-2 Vieillissement accéléré _____________________________________________________ 85
II-4-2 Modèle humain ______________________________________________________________ 86
II-4-2-1 Vieillissement naturel ______________________________________________________ 86
II-4-2-2 Vieillissement accéléré induit par passages successifs ____________________________ 86
II-4-2-3 Vieillissement accéléré induit par traitement au peroxyde d’hydrogène _____________ 86
II-4-2-4 Vieillissement accéléré induit par traitement au chlorure de sodium ________________ 86
II-5 Mesure de la viabilité cellulaire ______________________________________ 87
II-6 Mesure de l’activité de la Senescence Associated--galactosidase __________ 87
II-7 Analyse en PCR quantitative _________________________________________ 87
II-7-1 Extraction d’ARN _____________________________________________________________ 87
II-7-2 Analyse qualitative et quantitative des ARN ________________________________________ 88
II-7-3 Transcription inverse __________________________________________________________ 89
II-7-4 PCR temps réel _______________________________________________________________ 89
4
II-7-4-1 Principe _________________________________________________________________ 89
II-7-4-2 Mise au point ____________________________________________________________ 90
II-7-4-3 Protocole _______________________________________________________________ 90
II-8 Analyse protéique _________________________________________________ 91
II-8-1 Obtention des protéines à partir des milieux conditionnés ____________________________ 91
II-8-2 Extraction des protéines à partir des couches cellulaires______________________________ 91
II-8-3 Dosage protéique _____________________________________________________________ 91
II-8-4 Western-blot ________________________________________________________________ 91
II-8-4-1 Electrophorèse ___________________________________________________________ 91
II-8-4-2 Transfert ________________________________________________________________ 92
II-8-4-3 Immunodétection _________________________________________________________ 92
II-8-5 Dosage E.L.I.S.A (enzyme-linked immunosorbant assay) ______________________________ 92
II-8-5-1 Collagène IV _____________________________________________________________ 92
II-8-5-2 TGF-1__________________________________________________________________ 93
II-8-6 Etude des protéines phosphorylées : voie du TGF-1 ________________________________ 94
II-8-7 Immunoprécipitation des Smads phosphorylées ____________________________________ 95
II-9 Analyses statistiques _______________________________________________ 91
D.Résultats ____________________________________________ 97
I.Etude de l’expression du collagène IV lors du vieillissement naturel _____________ 98
I-1 Analyses à partir de peaux totales ____________________________________ 98
I-1-1 Analyse par western-blot sur peaux totales_________________________________________ 98
I-1-2 Analyse immunohistochimique __________________________________________________ 99
I-1-2-1 Marquage fluorescent ______________________________________________________ 99
I-1-2-1-1 Validation des coupes à étudier par mesure de la longueur de la JDE ____________ 99
I-1-2-1-2 Analyse du réseau de collagène IV au cours du vieillissement _________________ 101
I-1-2-2 Marquage révélé à la peroxydase ____________________________________________ 102
I-1-3 Etude du collagène IV de la JDE par microscopie RAMAN _____________________________ 104
I-2 Analyses à partir de fibroblastes dermiques ____________________________ 106
I-2-1 Fibroblastes issus de prépuces __________________________________________________ 108
I-2-2 Fibroblastes issus de seins _____________________________________________________ 108
I-2-2-1 Niveau génique __________________________________________________________ 108
I-2-2-2 Niveau protéique _________________________________________________________ 109
II. Mise au point d’un modèle de vieillissement accéléré pour étudier la diminution de
collagène IV __________________________________________________________ 111
II-1 Modèle murin ___________________________________________________ 111
II-1-1 Vieillissement naturel ________________________________________________________ 111
II-1-2 Vieillissement accéléré : souris SAM _____________________________________________ 112
5
II-2 Modèle humain __________________________________________________ 113
II-2-1 Vieillissement par passages successifs ___________________________________________ 113
II-2-1-1 Mise en évidence du phénotype sénescent ___________________________________ 114
II-2-1-1-1 Etude de la morphologie ______________________________________________ 114
II-2-1-1-2 Observation de l’activité de la SA -Galactosidase __________________________ 115
II-2-1-1-3 Etude de l’expression de collagène I _____________________________________ 116
II-2-1-1-4 Etude de l’expression de MMP-1 ________________________________________ 116
II-2-1-1-5 Etude de l’expression de gènes associés à la sénescence _____________________ 117
II-2-1-1-6 Etude de l’expression de gènes associés au cycle cellulaire ___________________ 117
II-2-1-2 Etude de l’expression du collagène IV ________________________________________ 118
II-2-1-2-1 Expression génique des chaînes 1 et 2(IV) ______________________________ 118
II-2-1-2-2 Expression protéique du collagène IV ____________________________________ 119
II-2-1-2-2-1 Par western-blot _________________________________________________ 119
II-2-1-2-2-2 Par dosage ELISA _________________________________________________ 120
II-2-2 Sénescence prématurée induite par le stress ______________________________________ 121
II-2-2-1 Test de viabilité au bleu trypan _____________________________________________ 122
II-2-2-2 Mise en évidence du phénotype sénescent ___________________________________ 124
II-2-2-2-1 Etude de la morphologie ______________________________________________ 124
II-2-2-2-2 Observation de l’activité de la SA--Galactosidase __________________________ 125
II-2-2-2-3 Etude de l’expression de collagène I _____________________________________ 126
II-2-2-2-4 Etude de l’expression de la MMP-1 ______________________________________ 127
II-2-2-2-5 Gènes associés au cycle cellulaire _______________________________________ 129
II-2-2-3 Etude de l’expression génique du collagène IV _________________________________ 130
II-2-2-3-1 Expression génique ___________________________________________________ 130
II-2-2-3-1-1 La chaîne 1(IV) _________________________________________________ 130
II-2-2-3-1-1 La chaîne 2(IV) _________________________________________________ 131
II-2-2-3-2 Expression protéique _________________________________________________ 133
II-2-2-3-2-1 Par western-blot _________________________________________________ 133
II-2-2-3-2-1 Par dosage E.L.I.S.A _______________________________________________ 135
III. Effet du TGF-1 sur l’expression du collagène IV par les fibroblastes dermiques
humains contrôles et sénescents _________________________________________ 136
III-1 Etude de l’effet dose du TGF-1 sur les fibroblastes contrôles ____________ 136
III-2 Effet de l’anticorps bloquant anti-TGF-1 sur la synthèse de collagène IV par
les fibroblastes contrôles _____________________________________________ 137
III-3 Etude de l’effet du TGF-1 sur les fibroblastes sénescents _______________ 138
IV. Etude du mécanisme impliqué dans la diminution du collagène IV au cours du
vieillissement _________________________________________________________ 140
6
IV-1 Etude des protéines phosphorylées : voie du TGF-1 ___________________ 140
IV-2 Etude de l’expression du TGF-1 et de son récepteur TGF-RII par les
fibroblastes vieillis artificiellement______________________________________ 141
IV-2-1 TGF-1 ____________________________________________________________________ 141
IV-2-1-1 Expression génique ______________________________________________________ 141
IV-2-1-2 Expression protéique ____________________________________________________ 142
IV-2-2 TRII _____________________________________________________________________ 143
IV-3 Etude de la voie des Smads ________________________________________ 144
E.Discussion __________________________________________ 146
F.Conclusion et perspectives _____________________________ 156
G.Bibliographie _______________________________________ 160
7
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Classification des collagènes et organisation supramoléculaire 23
Figure 2: Vue schématique de la localisation, de l’organisation génique, du produit génique et
de l’assemblage des 6 isoformes différents de collagène IV humain ___________________ 24
Figure 3: Régulation de la transcription des chaînes 1 et 2(IV) _____________________ 25
Figure 4: Représentation schématique de la formation du trimère de collagène IV _______ 26
Figure 5: Représentation schématique de la mise en place du réseau de collagène IV _____ 27
Figure 6: Epaisseur de la membrane basale et variation de collagène IV cutané __________ 29
Figure 7: Activation de la forme latente du TGF- ________________________________ 30
Figure 8: Activation du récepteur au TGF- _____________________________________ 31
Figure 9: Schéma simplifié de la voie des Smads par le TGF- ______________________ 32
Figure 10: Voies de signalisation de la famille des MAPK __________________________ 33
Figure 11: Représentation schématique de la voie PI3K/Akt _________________________ 34
Figure 12: Lien entre le photo-vieillissement, le TGF- et la synthèse de collagène ______ 35
Figure 13: Les 3 couches de la peau ____________________________________________ 39
Figure 14: Les couches de l’épiderme ___________________________________________ 40
Figure 15: Principaux composants et organisation des membranes basales ______________ 45
Figure 16: Représentation schématique de la jonction dermo-épidermique ______________ 47
Figure 17: Origine des espèces réactives de l’oxygène ______________________________ 54
Figure 18: Evolution de la durée de vie des fibroblastes en culture ___________________ 57
Figure 20: Action de la -galactosidase sur un galactoside __________________________ 60
Figure 21: Structure des télomères et apparence microscopique (adapté de Young, 2010) __ 63
Figure 22: Cycle cellulaire et implication des CDKI _______________________________ 64
Figure 23: Voie de signalisation de la réponse aux dommages à l’ADN ________________ 65
Figure 24: Mécanisme à la base de l’arrêt permanent du cycle cellulaire à la base de la
sénescence ________________________________________________________________ 66
Figure 25: Les 2 voies possibles par lesquelles les cellules sénescentes pourraient contribuer
au processus de vieillissement _________________________________________________ 67
Figure 26: Activation de la senescence par divers stimulis __________________________ 69
Figure 27 : Schéma de diffusion de la lumière ____________________________________ 84
Figure 28: Profil des ARN analysées sur puces Agilent _____________________________ 89
8
Figure 29: Principe du dosage ELISA anti TGF-1 ________________________________ 94
Figure 30: Principe de l’antibody array __________________________________________ 95
Figure 31: Etude, par western-blot, de l’expression du collagène IV natif à partir de prépuces
_________________________________________________________________________ 98
Figure 33: Détermination du degré d’invaginations de la JDE sur coupes transversales de
peaux humaines ___________________________________________________________ 100
Figure 34 : Etude de l’invagination de la JDE au cours du vieillissement à partir des coupes
marquées avec un anticorps anti-collagène IV ___________________________________ 100
Figure 35: Visualisation, en microscopie confocale, de la distribution du collagène IV sur
coupes transversales de peau au cours du vieillissement ___________________________ 101
Figure 36: Estimation de la continuité du réseau de collagène IV au cours du vieillissement.
________________________________________________________________________ 102
Figure 37: Visualisation, en microscopie optique, de l’expression du collagène IV sur coupes
transversales de peau au cours du vieillissement _________________________________ 103
Figure 38: Spectres RAMAN des collagènes I et IV purifiés ________________________ 105
Figure 39: Spectre moyen et déviation standard de l’épiderme, du derme et de la jonction
dermo-épidermique ________________________________________________________ 106
Figure 40: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression des chaînes 1 et 2(IV) par les
fibroblastes dermiques humains issus de prépuces et de seins au cours du vieillissement __ 107
Figure 41: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les
fibroblastes dermiques humains issus de prépuces au cours du vieillissement ___________ 108
Figure 42: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les
fibroblastes dermiques humains issus de seins au cours du vieillissement ______________ 109
Figure 43: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de la production de collagène IV par les fibroblastes
dermiques humains ________________________________________________________ 110
Figure 44: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression des chaînes 1, 2, 5 et 6(IV)
par des fibroblastes dermiques murins prélevés chez des souris âgées de 7 et 95 semaines 112
Figure 45: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression des chaînes 1 et 2(IV) par des
fibroblastes dermiques murins provenant de souris SAM __________________________ 113
Figure 46: Observation morphologique, par microscopie optique, des fibroblastes dermiques
cultivés aux passages 6 et 15 (objectif x40) _____________________________________ 114
Figure 47: Observation, par microscopie optique, de l’activité de la SA- galactosidase de
fibroblastes dermiques cultivés à p7 et p15. _____________________________________ 115
Figure 48: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(I) par les fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. _______________________________________ 116
9
Figure 49 : Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la MMP-1 par les fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. _______________________________________ 116
Figure 50: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de gènes associés à la senescence par
les fibroblastes dermiques cultivés aux passages 4 et 10. ___________________________ 117
Figure 51: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de p21WAF-1 et de p53 par les
fibroblastes dermiques cultivés aux passages 4 et 10. _____________________________ 118
Figure 52: Etude, par PCR temps réel, de l’expression des chaînes 1 et 2(IV) par les
fibroblastes dermiques cultivés aux passages 4 et 10. _____________________________ 119
Figure 53: Etude, par western-blot, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. _______________________________________ 119
Figure 54: Etude, par western-blot, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes
dermiques issus de patients âgés de 2 et 79 ans à différents passages _________________ 120
Figure 55: Etude, par dosage ELISA, de la production de collagène IV par fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. _______________________________________ 121
Figure 56: Récapitulatif du traitement des fibroblastes avec H2O2 ____________________ 122
Figure 57: Récapitulatif du traitement des fibroblastes avec NaCl ____________________ 122
Figure 58: Mesure, par coloration au bleu trypan, de la viabilité des fibroblastes dermiques
traités avec 0 à 200 µM d’H2O2 ______________________________________________ 123
Figure 59: Mesure, par coloration au bleu trypan, de la viabilité des fibroblastes dermiques
traités avec 150 à 300 mM de NaCl ___________________________________________ 123
Figure 60: Observation morphologique, par microscopie optique, des fibroblastes dermiques
humains traités avec des doses croissantes d’H2O2 ________________________________ 124
Figure 61: Observation morphologique, par microscopie optique, des fibroblastes dermiques
traités avec des doses croissantes de NaCl ______________________________________ 125
Figure 62: Observation, par microscopie optique, de l’activité de la SA- galactosidase de
fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 ______________________________ 125
Figure 63: Observation, par microscopie optique, de l’activité de la SA- galactosidase de
fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl _____________________________ 126
Figure 64: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(I) par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 ________________________________________ 127
Figure 65: étude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(I) par les fibroblastes
dermiques traités avec 225 mM de NaCl _______________________________________ 127
Figure 66: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la MMP-1 par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 ________________________________________ 128
10
Figure 67: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la MMP-1 par les fibroblastes
dermiques traités avec 225 mM de NaCl _______________________________________ 128
Figure 68: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de p53 et p21WAF-1 par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 ________________________________________ 129
Figure 69: étude, par PCR temps réel, de l’expression de p53 et p21 par les fibroblastes
dermiques traités avec 225 mM de NaCl _______________________________________ 130
Figure 70: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 ________________________________________ 131
Figure 71: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes
dermiques traités avec 225 mM de NaCl _______________________________________ 131
Figure 72: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 2(IV) par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 ________________________________________ 132
Figure 73: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 2(IV) par les fibroblastes
dermiques traités avec 225 mM de NaCl _______________________________________ 132
Figure 74: Etude, par western-blot, de l’expression de la chaîne 1(IV) _______________ 133
par les fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 _________________________ 133
Figure 75: Etude, par western-blot, de l’expression du collagène IV par les fibroblastes traités
avec 225 mM de NaCl ______________________________________________________ 134
Figure 76: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de la production de collagène IV _____________ 135
par les fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 _________________________ 135
Figure 77: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de la production de collagène IV _____________ 135
par les fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl ________________________ 135
Figure 78: Effet dose du TGF-ß1 sur l’expression du collagène de type IV dans des
fibroblastes dermiques humains ______________________________________________ 137
Figure 79: Effet de l’anticorps bloquant du TGF- sur la synthèse de collagène IV par les
fibroblastes dermiques humains ______________________________________________ 138
Figure 80: Etude, par PCR temps réel, de l’expression du collagène IV par les fibroblastes
sénescents _______________________________________________________________ 139
Figure 81: Etude, par PCR temps réel, de l’expression du TGF-par les fibroblastes
sénescents _______________________________________________________________ 142
Figure 82: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de l’expression du TGF-1 par les fibroblastes
dermiques humains vieillis artificiellement par traitement avec 100 µM d’H2O2 ________ 143
Figure 83 : Etude, par PCR temps réel, de l’expression du TRIIpar les fibroblastes
sénescents _______________________________________________________________ 144
11
Figure 84: Etude, par western-blot, de l’expression de smad2 et 3 et de leur forme
phoshoryléepar les fibroblastes sénescents _____________________________________ 145
12
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Comparaison de la différence d’expression de gènes d’intérêts de fibroblastes
jeunes et âgés .................................................................................................................... 61
Tableau 2 : Modification de l’expression de gènes lors de la sénescence prématurée induite
par H2O2 ............................................................................................................................ 71
Tableau 3: Variation de l’expression de protéines impliquées dans la voie du TGF-lors d’un
traitement avec 0 et 100 µM d’H2O2 .............................................................................. 141
13
LISTE DES ABBREVIATIONS
AC Anticorps
ADN Acide désoxyribonucléique
ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire
APS Persulfate d’ammonium
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager
ASK1 Apoptosis signal-regulating kinase-1
ATM Ataxia Telangiectasia Mutated
ATP Adenosine Tri-Phosphate
ATR Ataxia Telangiectasia Related
BET Bromure d’éthidium
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BMP Bone Morphogenetic Proteins
BSA Bovine Serum Albumine
CDK Cyclin dependent kinase
CHK Check-point kinase
CTCBF CTC-binding factor
CTGF Connective tissue growth factor
DAPI 4'-6-Diamidino-2-phenylindole
DEPC Diéthylpyrocarbonate
DHAE Déhydroépiandrostérone
DMEM Dulbecco's modified eagle's medium
14
DMSO Diméthylsulfoxyde
DNase Désoxyribonucléase
dNTPs Désoxyribonucléotides triphosphates
DP Doublement de population
DTT 1,4-dithiothréitol
E2F1 E2F transcription factor 1
ECL Electrochimioluminescence
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EHS Engelbreth-Holm-Swarm
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ERK Extracellular signal-Regulated Kinases
FACIT Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple helix
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase
GDF Growth and Differentation Factors
GPx glutathion-peroxidase
HBSS Hank's Balanced Salt Solution
HEPES N2 HydroxyEthylPiperazine-N’-2-Ethano-Sulfonique acid
HRP HorseRadish Peroxidase
IFN- Interferon-gamma
IL-1 Interleukin 1 beta
JDE Jonction Dermo-Epidermique
JNK c-Jun N-terminal Kinases
kDa Kilo Daltons
LAP Latency-Associated Peptide
LTBP Latent TGF- Binding Proteins
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinases
15
MEC Matrice ExtraCellulaire
MH1 Mad-Homology-1
MH2 Mad-Homology-2
MMP Matrix MetalloProteinase
PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1
pb Paire de bases
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PDK1 PhosphatidylInositol 3-Dependent Kinase 1
(PI3,4,5) P3 PhospIdylinositol-3,4,5-triPhosphate
PI3K PhosphoInositide-3-Kinase
POT1 Protection Of Telomere 1
PVDF Poly Vinylidène DiFluoride
RAP1 Repressor Activator Protein 1
Rb Protéine de rétinoblastome
RIPA Radio-ImmunoPrecipitation Assay
ROS Reactive Oxygen Species
RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SAB Sérum Albumine Bovine
SA -gal Senescence Associated beta-galactosidase
SAHF Senescence-Associated Heterochromatin Foci
SAM Senescence Accelerated Mice
SAP kinases Stress-Activated Protein kinases
SIPS Stress‐Induced Premature Senescence
SLC Small Latent Complex
SM22 Smooth Muscle protein of 22 kDa
16
SOD SuperOxyde Dismutase
SVF Sérum de Veau Fetal
t-BHP tertiary-Butyl HydroPeroxide
TBS Tris Buffered Saline
TAK1 TGF-β-activated kinase-1
TBS-T Tris buffered saline-tween
TEMED N N N’N’Tétraméthyl-éthylène-diamine
TβR Transforming Growth Factor Receptor
TGF β Transforming Growth Factor β
TIN2 TRF1 Interacting factor 2
TPP1 TriPeptidyl Peptidase 1
TRF1 Telomeric Repeat Binding Factor 1
TRF2 Telomeric Repeat Binding Factor 2
t-PA Tissu-Plasminogen Activator
TIMP Tissue Inhibitors of MétalloProtéases
UV UltraViolet
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
17
LISTE DES COMMUNICATIONS
Communications orales :
Journée des jeunes chercheurs 2012 (07 juin 2012) :
Etude de la diminution du collagène de type IV au cours du vieillissement cutané.
Communications par voie d’affiche :
Symposium international IFR 53 (7-9 juin 2010) :
Effect of aging on type IV collagen expression by dermal fibroblasts and kératinocytes
Scientific Meeting CRP santé Luxembourg-SFR CAP Santé REIMS (28 novembre 2011) :
Effect of aging on type IV collagen expression by dermal fibroblasts
50ème anniversaire de la SFBMEc (29 et 30 mars 2012) :
Study of type IV collagen decrease during aging and involved mechanisms
Congrès annuel de la SFBMEc (21 au 23 mars 2013) :
Study of type IV collagen expression by human dermal fibroblasts during aging
Journée des jeunes chercheurs 2013 (mai 2013) :
Study of type IV collagen expression by human dermal fibroblasts during aging
18
LISTE DES PUBLICATIONS
Articles publiés
NGUYEN T.T, HAPILLON T, FERU J, BRASSART-PASCO S, ANGIBOUST J.C,
MANFAIT M, PIOT O.
Raman comparison of skin dermis of different ages: focus on spectral markers of
collagen hydration
Journal of Raman Spectroscopy. 2013 Volume 44, Issue 9, pages 1230–1237.
NGUYEN T.T , GOBINET C , FERU J , BRASSART-PASCO S , MANFAIT M , PIOT O.
Characterization of Type I and IV Collagens by Raman Microspectroscopy:
Identification of Spectral Markers of the Dermo-Epidermal Junction.
Spectroscopy: An International Journal. 2012 ; Issue 5-6, Pages 421-427
BRASSART—PASCO S, SENECHAL K, THEVENARD J, RAMONT L, DEVY J, DI
STEFANO L, DUPONT-DESHOGUE A, BREZILLION S, FERU J, DIEBOLD M.D,
RICARD-BLUM S, MAQUART F.X, MONBOISSE J.C.
Tetrastatin, the NC1 domain of the α4(IV) collagen chain: a novel potent anti-
tumor matrikine.
PLoS One. 2012 ; 7(4) : e29587.
Articles en cours de rédaction
FERU J , DELOBBE E , DUPONT-DESHORGUES A , MAQUART F.X , BRASSART-
PASCO S.
Type IV collagen expression is decreased in dermal fibroblast upon exposure to non
toxic H2O2 concentrations and restored by TGF-1 treatment.
19
A. Introduction
A. Introduction
20
Le tissu conjonctif de la peau est composé de collagènes, d’élastine, d’acide hyaluronique, de
protéoglycannes et de nombreuses glycoprotéines. Le collagène représente 70 à 80 % du
poids sec de la peau et fournit au derme son intégrité mécanique et structurale. Le collagène
de type IV est l’un des composants majeurs de la membrane basale de la jonction dermo-
épidermique. Le vieillissement est généralement associé à un épaississement des membranes
basales. Cependant, au niveau de la peau, le contenu en collagène IV semble diminuer avec
l’âge (Vazquez et al., 1996) mais le mécanisme impliqué n’a pas été étudié à ce jour.
A. Introduction
21
I Les coll llagènes
I-1 Généralités
Les collagènes sont les protéines les plus abondantes du corps humain. Ils jouent un
rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité structurelle de la plupart des tissus. Ils sont par
ailleurs impliqués dans d'autres processus biologiques essentiels comme l'adhésion et la
migration cellulaire. La superfamille des collagènes, qui comprend 28 membres, est
particulièrement complexe et présente une remarquable diversité tant au niveau de
l'organisation moléculaire et supra-moléculaire qu'à celui de la distribution tissulaire et des
fonctions biologiques (Myllyharju et coll, 2004). Néanmoins, tous ses membres partagent une
caractéristique structurale commune, la présence dans leur structure d'un domaine en triple
hélice qui correspond à la répétition du triplet (Gly–X–Y)n (X étant fréquemment la proline et
Y l'hydroxyproline) dans la séquence d'acides aminés. Les collagènes sont classés en
plusieurs sous-familles déterminées en fonction des homologies de séquence, de similitudes
au niveau de l'architecture modulaire des chaînes polypeptidiques et de leur assemblage
supramoléculaire (Ricard-Blum et coll, 2005). 9 sous-familles sont alors définies (figure 1) :
- Les collagènes fibrillaires
- Les collagènes FACITs (Fibril Associated Collagens with Interripted Triple helix)
- Les collagènes à réseaux hexagonaux
- Les collagènes de membranes basales
- Les collagènes à filaments perlés
- Les collagènes des fibrilles d’ancrage
- Les collagènes transmembranaires
- Les collagènes à domaines en triple hélice multiples ou multiplexines
- Les autres collagènes
A. Introduction
22
Figure 1: Classification des collagènes et organisation supramoléculaire (Myllyharju et Kivirikko,
2004) La superfamille des collagènes peut-être divisée en 9 sous-familles sur la base de leur assemblage supramoléculaire et d’autres caractéristiques. Les chaînes polypeptidiques retrouvées dans les 27 premiers types de collagène sont codées par 42 gènes au total (représentés en bleu). Chaque chaîne contient un domaine N-terminal appelé 7S, un long domaine collagénique et un domaine C-terminal globulaire non collagénique appelé NC1. Les domaines collagéniques sont représentés en violet, les domaines N et C-terminaux sont représentés en rose foncé et les interruptions non collagénique au sein de la triple hélice sont représentées en bleu clair.
A. Introduction
23
I-2 Le collagène IV
Le collagène de type IV, composant majeur des membranes basales, est également
appelé “collagène formant des réseaux” (“network-forming collagen”), du fait de sa capacité à
s’auto-assembler en réseaux. Ce collagène est essentiel à l’intégrité et aux fonctions
biologiques des membranes basales (Myllyharju et Kivirikko, 2004); il intervient notamment
dans les mécanismes d’adhésion, de migration, de différenciation et de croissance cellulaire.
Le collagène de type IV est constitué de 3 chaînes polypeptidiques parmi 6 possibles
nommées alpha 1(IV) à alpha 6(IV). Les séquences en acides aminés des différentes chaînes
présentent 50 à 70% d’homologie. Malgré de très nombreuses combinaisons potentielles,
les chaînes interagissent et s’assemblent avec une très grande spécificité pour former
seulement 3 hétérotrimères différents : 112, 345, 556 (Khoshnoodi et coll,
2008). Les chaînes 1 et 2(IV) ont été les premières décrites et sont donc appelées chaînes
« classiques ». Elles sont présentes dans les membranes basales de tous les tissus tandis que
les 4 autres chaînes ont des distributions restreintes à certains tissus.
I-2-1 Organisation génique et régulation
Les gènes codant pour les 6 chaînes sont localisés par paires sur trois chromosomes
différents. Les gènes COL4A1 et COL4A2 humains, situés sur le chromosome 13, sont
orientés face à face et connectés par un promoteur commun de 127 pb (Pollner et coll, 1990).
Les gènes COL4A5 et COL4A6 sont disposés de la même façon sur le chromosome X et sont
séparés par un promoteur commun de 437 pb. Les gènes COL4A3 et COL4A4 sont retrouvés
sur le chromosome 2 (figure 2). Les analyses de séquences de quelques espèces de
mammifères ont permis de mettre en évidence un gène ancestral commun, qui, après 6
duplications consécutives, a donné naissance à 6 gènes. En se basant sur leur similarité de
séquence, les gènes ont été divisés en 2 groupes : le groupe « 1-like » qui comprend
COL4A1, COL4A3 et COL4A5 et le groupe « 2-like » qui comprend COL4A2, COL4A4 et
COL4A6.
A. Introduction
24
Figure 2: Vue schématique de la localisation, de l’organisation génique, du produit génique et de
l’assemblage des 6 isoformes différents de collagène IV humain (Khoshnoodi et coll, 2008) Les gènes COL4A1/COL4A2 sur le chromosome 13 (A), COL4A3/COL4A4 sur le chromosome 2 (B) et COL4A5/COL4A6 sur le chromosome X (C) sont organisés par paires, tête-bêche et séparés par un court promoteur commun. Les paires de gènes sont transcrits selon un mode bidirectionnel et
traduits en chaînes individuelles.
Le promoteur commun des gènes COL4A1 et COL4A2 ne possède pas d’activité
transcriptionnelle par lui-même. Chaque gène contient une région activatrice dans la zone
située en bordure du premier intron et du premier exon, qui active le promoteur soit dans la
direction d’1(IV) soit dans celle d’2(IV) (Kefalides et Borel, 2005). Un silencer régule
également la transcription de ces deux gènes (figure 3B). Au niveau de COL4A1, le premier
exon code pour une région 5’ non traduite et pour le peptide signal tandis que pour COL4A2
cette même région est divisée en 3 exons (figure 3A). 3 éléments cis-régulateurs différents,
une boite GC, un motif CCAAT et une boite CTC fixent respectivement et spécifiquement le
facteur de transcription sp1, un CCAAT-binding factor similaire à CP1, et un nouveau facteur
découvert récemment, le CTC-binding factor (CTCBF). Ces motifs sont présents non
seulement sur le promoteur mais aussi sur les deux régions activatrices, distribuées des deux
côtés du promoteur (figure 3C). En dépit des nombreuses études sur la régulation de ces
gènes, le mécanisme n’est toujours pas mis en évidence. Par exemple, les niveaux d’ARNm
pour les chaînes 1(IV) et 2(IV) varient selon les cellules mais également selon les
conditions, bien que le ratio de chaînes traduitesdans la molécule 112 reste toujours le
même. Cela indique que l’expression génique des chaînes du collagène IV est hautement
régulée à différents niveaux tels que la transcription, la stabilité et l’épissage des ARNs,
l’efficacité de la traduction et des modifications post-traductionnelles et enfin la
A. Introduction
25
reconnaissance chaîne spécifique des différentes chaînes dans la cellule. La transcription
donne un ratio final 1(IV) /2(IV) de ½. Les produits de transcriptions de ces gènes
subissent des réactions d’excision et d’épissage successives pour donner des ARNm matures
qui sont ensuite traduits dans le réticulum endoplasmique.
Figure 3: Régulation de la transcription des chaînes 1 et 2(IV)(Kühn, 1994) Les deux gènes sont localisés sur le chromosome 13, tête-bêche et sous le contrôle d’un promoteur commun de 127 pb. Au niveau du gène COL4A1, le premier exon code pour une région en 5’ non traduite et pour le peptide signal. Pour le gène COL4A2, la région correspondante est divisée en 3 exons. Chaque gène contient une région activatrice qui active le promoteur soit dans
la direction d’1(IV), soit dans celle d’2(IV). Un silencer influence la transcription également. 3 éléments cis-régulateurs sont présents au niveau du promoteur.
I-2-2 Structure du collagène IV
La molécule de collagène IV comporte 3 domaines distincts : le premier est un
domaine de 30 nm de long, constitué par une triple hélice contenant de nombreuses zones
imparfaitement hélicoïdales, situé à l’extrémité N-terminale dit le domaine 7S. Le domaine 7S
de chaque chaîne comporte environ 15 acides aminés. Ce domaine est facile à isoler par
ultracentrifugation, et sédimente avec un coefficient de Sverdberg égal à 7S, d’où son nom; le
A. Introduction
26
second domaine est un domaine central à triple hélice qui est le plus long puisqu’il est
constitué d’environ 1400 acides aminés pour chaque chaîne et mesure 360 nm de long. Il est
constitué de l’enchainement d’une séquence classique et répétitive Gly-Xaa-Yaa et il
comprend de 21 à 26 interruptions non collagéniques. Ces interruptions confèrent non
seulement une flexibilité moléculaire mais aussi des sites de fixation cellulaire et de liaisons
croisées interchaînes. Le dernier est un domaine carboxy-terminal, globulaire, non
collagénique, appelé le domaine NC1. Le domaine NC1 de chaque chaîne alpha est constitué
d’environ 230 acides aminés. Le domaine NC1 a un rôle important dans l’assemblage de la
triple hélice puisqu’il initie l’interaction moléculaire entre 3 chaînes La trimérisation en
protomère se réalise ensuite selon un modèle en « fermeture éclair » à partir de l’extrémité
carboxy-terminale (figure 4). Cette étape est réalisée dans l’appareil de Golgi. Le domaine
NC1 est sensible à la pepsine et résistant à la collagénase bactérienne. L’inverse est observé
pour le domaine en triple hélice.
Figure 4: Représentation schématique de la formation du trimère de collagène IV (Kalluri, 2003)
La sélection des chaînes pour l'association en protomère à triple hélice est gouvernée par la reconnaissance de séquences moléculaires codées par les régions hypervariables du domaine NC1. L’assemblage des 3 chaînes est initié au niveau des domaines NC1 puis progresse jusqu’au domaine 7S.
A. Introduction
27
I-2-3 Mise en place du réseau de collagène IV
Le collagène de type IV ne forme pas de fibrilles, mais il polymérise sous forme de
réseau, qui constitue l’essentiel de la lamina densa de la membrane basale. La première étape
est la formation de dimères à partir de deux protomères de collagène IV qui se réalise à partir
de leur domaine NC1 et qui permet d’obtenir un hexamère (figure 5). Ces dimères sont
stabilisés par des ponts disulfures interchaînes, qui se forment grâce à la présence de 12
résidus cystéine hautement conservés dans les 6 chaînes (IV). C’est ensuite la formation de
tétramères qui se fait suite à l’interaction de 4 protomères via leurs régions 7S glycosylées,
deux dans un sens et deux dans le sens opposé (Duncan et coll, 1983). Cela se fait par
l’intermédiaire de nombreux ponts disulfure, ainsi que par des liaisons croisées dérivées de la
lysine et de l’hydroxylysine (Bailey et coll, 1984). Toutes ces interactions forment le noyau
de l’architecture du réseau de collagène IV. L’ensemble des dimères et des tétramères se
combinent pour former un maillage très résistant. La présence de nombreux résidus riches en
cystéine et en lysine est essentielle pour la formation de liaisons interchaînes de 4 protomères
via des ponts disulfures et des liaisons croisées lysine-hydroxylysine. Le tétramère est
hautement glycosylé sur des résidus lysine du domaine collagénique et sur des résidus
asparagine de l’extrémité N-terminale (Nayak, 1991).
Figure 5: Représentation schématique de la mise en place du réseau de collagène IV (Adapté de Kalluri, 2003)
2 protomères se dimérisent via leur domaine NC1. 4 protomères interagissent via leur domaine 7S. Ces interactions forment le noyau de l’architecture du réseau de collagène IV.
protomer
dimer NC1 hexamer
Type IV collagen tetramer
7S domain
7S domain NC1 hexamer
Type IV collagen suprastucture
A. Introduction
28
I-2-4 Distribution tissulaire des chaînes (IV)
L’hétérotrimère 112(IV) est majoritaire et ubiquitaire. On le retrouve dans toutes
les membranes basales de l’organisme tandis que les 2 autres hétérotrimères ont une
distribution plus restreinte et tissu-spécifique. 112(IV) est retrouvé au niveau des
membranes basales glomérulaires immatures mais est ensuite remplacé par 345(IV).
345(IV) est également retrouvé au niveau des membranes basales de l’œil, de la cochlée,
du poumon et du testicule tandis que le trimère 556(IV) est retrouvé au niveau des
membranes basales de la peau (Jonction Dermo Epidermique ou JDE), de l’œsophage, de la
capsule de Bowman, du rein et des cellules musculaires lisses (Steinhoff, 2011).
I-2-5 Collagène IV et pathologies
L’une des principales pathologies liées au collagène IV est le syndrome d’Alport et est
caractérisé par une néphropathie progressive conduisant à une protéinurie, une hypertension et
ultimement à une insuffisance rénale. Il est retrouvé sous deux formes : une forme héréditaire
appelée syndrome d’Alport lié à l’X et qui est dû à une mutation du gène COL4A5. L’autre
est la forme autosomale dominante ou autosomale récessive et est due à une mutation des
gènes COL4A3 et COL4A4. La néphropathie à membrane basale fine est également due à des
mutations hétérozygotes de ces gènes (Kashtan, 2003). Le syndrome de Goodpasture est une
maladie rare auto-immune caractérisée par la présence d’auto-anticorps réagissant avec le
domaine non collagénique de la chaîne 3(IV) des membranes basales glomérulaires. Il est
caractérisé par une glomérulonéphrite nécrosante, parfois accompagnée d’hémorragies
pulmonaires (Alenzi et coll, 2012). De plus, des taux élevés de collagène IV sont retrouvés
dans le sérum de patients atteints de nombreux cancers métastatiques tels que le cancer du
sein, colorectal, gastrique et le cancer des poumons mais aussi du foie (Mazouni et coll,
2008), si bien qu’il pourrait devenir un marqueur pour la détection des cancers colorectaux
métastatiques (Nyström et coll, 2011).
I-2-6 Collagène IV et vieillissement
Au niveau de la peau, une étude, réalisée par Vasquez en 1996, a montré que, bien que
l’épaisseur de la membrane basale augmentait, le contenu en collagène IV diminuait avec
l’âge à partir de 35 ans (Vasquez et coll, 1996) (figure 6). Une étude de Le Varlet en 1998 a
A. Introduction
29
également montré, grâce à des immunomarquages, qu’il y avait moins de collagène IV dans
les JDE de patients âgés par rapport aux JDE de patients jeunes (Le Varlet et coll, 1998). Il a
été montré que dans certaines membranes basales telles que la membrane limitante interne
(Candiello et coll, 2010) et les membranes basales du cortex rénal (Karttunen et coll, 1986),
les concentrations en collagène IV augmentaient.
Figure 6: Epaisseur de la membrane basale et variation de collagène IV cutané (Vazquez et coll,
1996) L’évaluation morphométrique de la membrane basale, réalisée en microscopie électronique, montre une corrélation entre son épaisseur et l’âge des patients. L’ analyse densitométrique de marquages immunohistochimiques montre une diminution du contenu en collagène IV de la membrane basale en fonction de l’âge. Une corrélation négative entre ces deux paramètres a été mise en évidence.
I-3 Régulation de la synthèse de collagène IV par le TGF-
I-3-1 Le TGF-
I-3-1-1 Généralités
La superfamille du TGF-est une famille de facteurs sécrétés d’environ 30 membres
divisés en deux sous familles: les BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) et les GDFs (Growth
and Differentation Factors) d’une part, et les activines, les nodales et le TGF-d’autre part
(Massagué et coll, 2000). Le TGF-estun facteur de croissanceubiquitaire impliqué dans la
régulation de la croissance cellulaire et de la différenciation. Il existe trois isoformes
humaines du TGF-, TGF-1, TGF-2 et TGF-3, codées par trois gènes distincts. Ces
A. Introduction
30
isoformes sont, du point de vue structural, très similaires (neuf résidus cystéines conservés, 76
à 80% d’identité entre les séquences protéiques).
I-3-1-2 Synthèse et sécrétion
Le TGF-est sécrété sous forme d’un LLC (large latent complexe) composé d’une
LTBP (latent TGF-binding protein (115-240 kDa)) liée de manière covalente au propeptide
situé en position N-terminale du précurseur du TGF-(75 kDa) aussi appelé LAP (latent
associated protein) et au TGF-(25 kDa) (Fontana et coll, 2005) (figure 7).
Figure 7: Activation de la forme latente du TGF- (Gressner et coll, 2002)
Le petit complexe latent est composé du TGF-β lié de façon non covalente à un peptide LAP qui le maintient sous une forme latente, incapable de se lier à ses récepteurs. Le petit complexe latent se lie via des ponts disulfure à une LTBP (Latent TGF-beta Binding Protein) pour former ainsi le LLC (Large Latent Complex). La libération et l’activation de la forme latente sont des évènements clés dans la régulation de la réponse au TGF-β.
I-3-1-3 Activation du récepteur
Chez les mammifères, il existe 5 récepteurs TGF-de type I et 7 récepteurs de type II
qui font partie de la famille des récepteurs sérine/thréonine kinase. Pour chaque membre de la
famille du TGF-β, il existe une combinaison caractéristique de TβR-I et TβR-II. En absence
de ligand, ces récepteurs se trouvent sous forme d'homodimères à la surface de la cellule. Le
TGF-β1 se lie à TβR-II avec une haute affinité et ceci permet le recrutement de TβR-I.
A. Introduction
31
L'hétérodimérisation de TβR-I et TβR-II permet une transphosphorylation de TβR-I par
TβRII. TβR-I phosphorylé peut alors activer, entre autres, les protéines Smads, ce qui
permettra la transduction du signal jusqu'au noyau (Shi and Massague, 2003) (figure 8).
Figure 8: Activation du récepteur au TGF- (sciencebio.com)
Le TGF-β1 se lie au TβR-II permettant alors le recrutement de TβR-I. L'hétérodimérisation de TβR-I et TβR-II permet une transphosphorylation de TβR-I par TβRII. TβR-I phosphorylé peut alors activer les protéines cibles.
I-3-1-4 Voies de signalisation impliquées
I-3-1-4-1 La voie des Smads
Les Smads se subdivisent en 3 familles: les R-Smads qui sont les substrats directs des
récepteurs kinase de la famille du TGF-β, les Co-Smads qui participent à la transduction du
signal en s'associant avec les R-Smads, et les I-Smads ou Inhibitory Smads qui inhibent la
signalisation des deux autres groupes. Les R-Smads et les Co-Smads sont constitués d’un
domaine conservé MH1 (Mad-homology-1) et d’un domaine C-terminal MH2 (Mad-
homology-2) connectés par un segment « linker ». Le domaine C-terminal est responsable de
l’activité transcriptionnelle lorsqu’il est fusionné à un domaine de fixation à l’ADN. Les I-
Smads contiennent seulement le domaine MH2, ce sont des antagonsistes des R-Smads (Li et
coll, 2001). Les R-Smads regroupent Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 et Smad8 mais seuls
Smad2 et Smad3 sont impliqués dans la voie du TGF-β. En ce qui concerne les I-Smad,
A. Introduction
32
Smad6 et Smad7, seul Smad7 intervient dans la voie du TGF-β. Pour les Co-Smads, l'unique
protéine connue dans cette famille est Smad4. Après activation du récepteur, les R-Smads
vont recruter Smad4, qui est appelée co-smad et ce complexe est alors transloqué dans le
noyau où il régule l’expression de nombreux gènes cibles (figure 9). Les I-Smads (Smad 7
pour la voie du TGF-agissent à deux niveaux : en se liant directement à TβRI et en inhibant
ainsi la phosphorylation des R-Smads et en interagissant avec Smurf1/2, protéine de la famille
des E3 ubiquitine ligases.
Figure 9: Schéma simplifié de la voie des Smads par le TGF-Derynck et Zhang, 2003)
A la surface cellulaire, le ligand se fixe à un complexe de récepteurs transmembranaires et induit la phosphorylation du segment GS (représenté en vert) du récepteur de type I par le récepteur de type II qui pourra alors phopshoryler les Smads d’intérêt qui formeront un complexe avec Smad 4. Ce complexe transloquera dans le noyau ou il régulera la transcription de gènes d’intérêt.
I-3-1-4-2 La voie des MAP kinases
La famille des MAPKs est divisée en trois sous-familles: les ERKs (ERK1 et ERK2)
(Extracellular Signal-regulated Kinases), les SAP kinases (Stress-Activated Protein kinases)
comme JNK1, JNK2 et JNK3 (c-Jun N-terminal kinases) et les p38/MAPKs (α, β, γ et δ).
L'activation des voies MAPKs se fait de façon séquentielle. Tout d'abord, suite à une
stimulation par des cytokines ou des facteurs de croissance, des récepteurs à activité tyrosine
A. Introduction
33
kinases ou des récepteurs couplés à des protéines G associés à la membrane activent des
MAPK kinase kinase (MAPKKK). Les MAPKKK activent des MAPKK (MAPK kinase)
menant à l'activation par phosphorylation de MAPKs qui pourront alors phosphoryler toute
une série de facteurs de transcriptions. Les ERKs sont phosphorylées par les MAPKKs,
MEKK1 et MEKK2, qui sont elles-mêmes les substrats de la MAPKKK Raf-1. Les JNKs sont
les substrats de MKK4 et MKK7 alors que p38MAPK est phosphorylée par MKK3 et MKK6,
elles-mêmes activées par plusieurs MAPKKKs incluant ASK1 (apoptosis signal-regulating
kinase-1) et TAK1 (TGF-β-activated kinase-1) (figure 10). Ces kinases peuvent jouer un rôle
dans l’apoptose et la transition epithélio-mesenchymateuse induites par le TGF- β. La
convergence entre les voies Smad et MAPK activées par le TGF- β aboutit souvent vers une
coopération dans la régulation transcriptionnelle des gènes cibles.
Figure 10: Voies de signalisation de la famille des MAPK (Roberts et Der, 2007) Il y a 4 formes majeures de cascades MAPKKK-MAPKK-MAPK protéines kinases. Alors que la voie ERK est le plus souvent activée par des facteurs de croissance, les voies JNK, p38 et ERK5 sont activées par des stress environnementaux.
I-3-1-4-3 La voie des PI3K/Akt
Des études ont montré que le TGF- était capable d’induire l’augmentation
d’expression du collagène I, non seulement via la voie des Smads, mais aussi par la voie
PI3K/Akt dans les cellules mésangiales (Runyan et coll, 2004). Cette voie a également un rôle
A. Introduction
34
dans la transition épithelio-mésenchymateuse (Lamouille et Derynck, 2011). La
phosphoinositide 3 kinase (PI3K) participe à la formation d’un composé lipidique
membranaire, le phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PI(3,4,5)P3). Ce composé recrute la
sérine/thréonine kinase AKT à proximité de la membrane plasmique, où elle est alors
phosphorylée (et activée) par la PDK1 (phosphatidylinositol 3-dependent kinase 1) (Dreyer et
coll, 2009) (figure 11).
Figure 11: Représentation schématique de la voie PI3K/Akt (Garcia-Echeverria et Sellers, 2008). Après activation, le recrutement de PI3K au récepteur tyrosine kinase conduit à une augmentation des niveaux de PIP3. Ce phospholipide recrute alors des protéines telles qu’Akt qui seront phosphorylées sur deux résidus distincts par PDK1 et 2. Akt phosphorylée peut alors activer les voies de signalisation en amont.
I-3-2 Rôle dans la synthèse de collagène
I-3-2-1 Collagène I
Il est maintenant établi que le TGF- est un régulateur majeur de la production des
constituants de la matrice des tissus conjonctifs de la peau humaine. Le TGF-β est sans aucun
doute le plus connu des facteurs profibrosants. Il est chimiotactique pour les fibroblastes, il
stimule leur prolifération, il inhibe la synthèse de collagénases et augmente la synthèse des
inhibiteurs des métalloprotéases que sont les TIMPs (pour Tissue Inhibitors of
MétalloProtéases) et le PAI-1 (pour Plasminogen Activator Inhibitor 1). Ses effets sur la
production de matrice extracellulaire par les cellules fibroblastiques ont pu être confirmés in
A. Introduction
35
vivo dans plusieurs modèles. Les mécanismes intracellulaires responsables des effets du TGF-
β sont beaucoup mieux compris depuis l’identification des protéines Smads, qui relaient tout
ou partie des effets intracellulaires du TGF-β. Dans les cellules mésangiales, l’induction du
promoteur du collagène de type I par le TGF- requiert également la cascade ras/MEK/ERK
MAP kinase (Leask et abraham, 2004). De plus, un élément de réponse au TGF-β (appelé
CyRC ou TbRE) a été clairement identifié au sein du promoteur proximal de COL1A2 et
étudié en détail. Il a été suggéré que la production de collagène par les fibroblastes stimulés
avec TGF- pouvait être liée à la différenciation cellulaire et à la transformation des
fibroblastes en myofibroblastes (Pertrov et coll, 2002). L'expression du TGF beta par les
kératinocytes augmente au cours du développement (kératinocytes foetaux versus
kératinocytes de nouveaux né et d'adultes), ainsi que l'expression de
collagène I (Colwell et coll, 2002).Il s’avère également que lors du photo-vieillissement,
c’est la diminution d’expression du TGF-β ou de son récepteur qui induit la diminution de
collagène (Zhong et coll, 2011) (figure 12).
Figure 12: Lien entre le photo-vieillissement, le TGF- et la synthèse de collagène (Zhong et coll,
2011)
Les radiations UV peuvent réguler négativement l’expression du TGF- ou bien de son récepteur menant alors à la diminution du nombre ou à l’apoptose des fibroblastes aussi bien qu’a l’activation d’AP-1. Ces phénomènes induisent l’augmentation d’expression des MMPs, de la Cathepsine G etc… ce qui a pour conséquence de diminuer la production de collagène et d’élastine et d’augmenter la dégradation des composés de la MEC.
A. Introduction
36
De plus, lors du vieillissement chronologique il a été observé une diminution
d’expression de TGF- corrélée à une diminution d’expression de procollagène I par les
fibroblastes (Quan et coll, 2010 ; Oliver et coll, 2010) ce qui apporte une preuve que la
diminution du collagène I au cours du vieillissement est due, en partie, à une diminution du
TGF-et/ou de son récepteur.
I-3-2-2 Collagène IV
Le TGF- induit l’expression génique des chaînes 1 et 2(IV) dans les cellules NIH-
3T3 (fibroblastes dérivant d’embryons de souris) ainsi que dans les fibroblastes rénaux de rats
(Grande et coll, 1993). Dans les cellules mésangiales, cette induction de synthèse de collagène
IV par le TGF- se réalise via un mécanisme impliquant Smad 2 et la voie des MAPKs (Jiang
et coll, 2010). Il est également un médiateur autocrine de la production de collagène IV par
les cellules épithéliales des tubulles rénaux (Grande et coll, 2002).
Lors d’un diabète mellitus, il semblerait que ce soit un effet autocrine ou paracrine qui
soit responsable de l’augmentation de collagène IV dans les cellules endothéliales (Sternberg
et coll, 1993). L’angiotensine II stimule la production de la chaîne 3(IV) via un mécanisme
impliquant la voie de signalisation du TGF- et du VEGF (Chen et coll, 2005).
De fortes concentrations en glucose induisent une augmentation de la production de collagène
IV par un mécanisme impliquant le TGF-dans les cellules des tubulles proximaux (Du et
coll, 2010). Il s’avère donc que, comme pour le collagène I, le TGF-est impliqué dans la
synthèse de collagène IV dans un certain nombre de types cellulaires.
A. Introduction
37
II.La peau
II-1 Fonctions physiologiques de la peau
II-1-1 Protection
La fonction la plus importante de la peau est de former une barrière effective entre
« l’intérieur » et « l’extérieur ». Cela comprend une barrière physique, une barrière
chimique/biochimique et une barrière immunitaire (Proksch et coll, 2008).
Barrière physique
La peau est soumise à de nombreuses et fréquentes agressions mécaniques : tractions
aux articulations, chocs, frottements… elle doit les amortir afin de préserver sa propre
intégrité et cette protection va se réaliser à 3 niveaux :
- grâce à la kératine de la couche cornée, une solide barrière qui oppose au stress son
élasticité, sa dureté et sa résistance à la friction. La desquamation continuelle de ces cellules
élimine les microorganismes qui s’y attachent.
- grâce aux fibres du derme : les fibres de collagène, qui confèrent à la peau leur force de
tension, et les fibres élastiques, grâce auxquelles la peau revient en place après étirement.
- le coussin graisseux de l’hypoderme, qui protège les muscles et les os sous-jacents contre les
chocs et les pressions.
Barrière chimique/biochimique
Elle permet de lutter contre les allergènes, les germes et les éléments irritants. La peau est
recouverte d'un mélange composé entre autres d'acides gras, de sébum et de peptides
antibactériens. Le pH à la surface de la peau est maintenu acide (entre 4 et 5). Toutes ces
conditions sont néfastes à la survie de nombreuses bactéries.
Barrière immunologique
La fonction de protection contre les microorganismes intervient également à plusieurs
niveaux :
- la couche cornée : qui rend la plupart des pathogènes imperméables à la peau.
A. Introduction
38
- les cellules de la défense immunitaire : les cellules de langerhans siégeant dans l’épiderme et
les leucocytes siégeant dans le derme.
- les glandes sébacées: qui produisent le sébum à action bactéricide et fongicide.
- la desquamation permanente: qui élimine les germes présents.
Photoprotection
Il s’agit de la protection contre les rayonnements solaires qui se fait de plusieurs façons :
- la pigmentation : les mélanines ont une capacité de diffraction et de réflexion de la lumière
ainsi que d’absorption photonique et de piégeurs de radicaux libres.
- les mécanismes de réparation de l’ADN : ce sont les mécanismes de dernier recours quand
les photons ont échappés aux autres moyens de protection. Il en existe plusieurs types. La
réparation par excision de nucléotides représente la principale défense contre les effets
génotoxiques du rayonnement solaire. Il y a aussi la réparation post-réplicative qui est un
mécanisme d’urgence quand la cellule en division est lésée par les UV, mais ce système peut
faire des erreurs (Beani, 2012).
II-1-2 Détection des informations extérieures
Les terminaisons nerveuses contenues dans la peau, et notamment au bout des doigts,
permettent à l'homme d'explorer son environnement par le toucher. La peau permet ainsi une
sensibilité à la pression, à la température, et à la douleur. Elle possède quatre types de
récepteurs, qui réagissent en fonction de stimuli différents, et qui renvoient des informations
interprétables par le cerveau. Ces informations parcourent la colonne vertébrale, jusqu’au
thalamus via deux types de canaux : l’un pour les informations concernant la douleur et la
température, l’autre pour le toucher à proprement parler (texture, dureté, etc…).
Les 4 types de récepteurs sont les cellules de Merkel (pression), les corpuscules de Meissner
(tactile), les corpuscules de Ruffini (chaleur), les corpuscules de Pacini (tactile).
II-1-3 Maintien de la température corporelle (thermorégulation)
La peau contient en effet un très vaste réseau de vaisseaux sanguins. Quand il fait
chaud, ces vaisseaux se dilatent, permettant alors d’augmenter la surface du réseau sanguin et
de libérer plus de chaleur dans le milieu extérieur. En même temps, la peau produit de la sueur
grâce aux glandes sudoripares, ce qui rafraîchit également le corps. Quand il fait froid, les
A. Introduction
39
vaisseaux sanguins de la peau vont au contraire se contracter, ce qui limite les pertes de
chaleur du corps dans le milieu extérieur. La circulation cutanée se fait alors principalement
dans les couches profondes, le tissu adipeux jouant un rôle d’isolant thermique. En surface
cutanée, les échanges caloriques entre le sang et le milieu extérieur se trouvent ainsi limités.
Les poils interviennent dans la régulation thermique par leur rôle isolant contre le froid ou le
chaud, ils créent une couche d'air isolante entre la peau et les poils.
II-2 Structure
La peau humaine a une surface d’environ 2 m² chez l’adulte et représente un sixième du
poids corporel. Elle est constituée de différents tissus formant une barrière vitale pour
l’organisme vis-à-vis de l’environnement extérieur. Elle est formée de trois parties :
l'épiderme, le derme et l'hypoderme (figure 13).
Figure 13: Les 3 couches de la peau (http://www.alep-soap.com)
La peau comprend trois couches superposées, l'épiderme, le derme et l'hypoderme.
II-2-1 L’épiderme
L’épiderme est la couche la plus superficielle de la peau. L’épaisseur moyenne de
l’épiderme est de 100 µm mais peut varier de 50 µm sur les paupières à 1 mm sur la paume
des mains ou la plante des pieds. L’épiderme n’est irrigué par aucun vaisseau sanguin et est
seulement alimenté par diffusion depuis le derme. Il contient en revanche de nombreuses
terminaisons nerveuses. L’épiderme est constitué à 95% de kératinocytes. Les mélanocytes,
les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel forment les 5% restant. Il se compose de
A. Introduction
40
quatre à cinq couches distinctes (selon le site anatomique). C'est un système cinétique
hautement organisé, en renouvellement constant. Les cellules épidermiques prolifèrent au
niveau de sa couche la plus profonde : la couche basale, et se différencient au cours de leur
migration vers les couches supérieures pour former successivement la couche épineuse, la
couche granuleuse, la couche claire et la couche cornée (figure 14).
Figure 14: Les couches de l’épiderme (polgm.free.fr) L’épiderme de la peau épaisse se compose de cinq couches distinctes, de la plus profonde à la plus superficielle: la couche basale (ou stratum germinativum ), la couche épineuse (ou stratum spinosum ), la couche granuleuse (ou stratum granulosum ), la couche de claire (stratum lucidum ) et la couche cornée (ou stratum corneum ).
II-2-1-1 La couche cornée (stratum corneum)
C’est l’épiderme vivant (les couches basale, épineuse et granuleuse), qui est
responsable de la formation et du renouvellement de la couche cornée. Elle est constituée de 5
à 15 couches de cellules et représente la couche la plus externe de l’épiderme en contact avec
l’environnement extérieur. Pendant leur différenciation et leur maturation, les kératinocytes
synthétisent et expriment différents types de protéines de structure et différents lipides.
L’étape finale de cette différenciation, associée à de profonds changements de structure,
donne naissance aux cornéocytes qui sont des cellules mortes, plates, contenant de l’eau et de
la kératine. Ces cornéocytes sont incorporés dans une matrice lipidique. C’est ce qui a incité
Michaels et son équipe, en 1975, à comparer cette couche à « des briques et du mortier ». Les
lipides du mortier qui remplissent le sentier tortueux entre les cornéocytes empilés sont
constitués d’un mélange complexe d'environ 13 espèces de céramides, cholestérol et acides
gras libres ; ceux-ci fournissent la barrière de perméabilité. La couche cornée comporte deux
A. Introduction
41
parties, une partie où les cornéocytes sont encore reliés les uns aux autres grâce aux
cornéodesmosomes, et une autre partie où, sous l’action d’enzymes spécifiques, les
cornéodesmosomes se dégradent, permettant aux cornéocytes de se détacher : c’est la
desquamation. De cette façon, l'épiderme est constamment renouvelé tous les 25 à 40 jours.
II-2-1-2 La couche claire (stratum lucidum)
La couche claire est une couche morte homogène qui ne s'observe que dans la peau
épaisse et qui correspond à une zone de transition entre la couche cornée et la couche
granuleuse. Elle est constituée de 3 ou 4 assises de cellules jointives et a pour mission de
servir de barrière à la peau, contre les agressions physiques (coupures, piqures, …) mais aussi
chimiques (xénobiotiques, solvants).
II-2-1-3 La couche granuleuse (stratum granulosum)
C’est le lieu d’accumulation de la kératine. Elle est composée de 1 à 3 couches de
cellules et est constituée de cellules granuleuses aplaties chargées de kératine et dont le noyau
dégénère progressivement. Le cytoplasme des cellules de la couche granuleuse contient des
grains de kératohyaline provoquant la maturation de la filaggrine. La filaggrine est une
protéine située dans les couches les plus superficielles de l’épiderme. La profilaggrine,
protéine riche en histidine, est le principal composant des grains de kératohyaline du stratum
granulosum. Au cours de la différenciation terminale, la profilaggrine est déphosphorylée puis
partiellement protélolysée en composés intermédiaires, puis en filaggrine. La filaggrine
possède la capacité d’agréger les filaments de kératine en catalysant la formation des ponts
disulfures entre les filaments de kératine. Elle entre dans la composition de l’enveloppe
cornée. Elle joue un rôle dans l’hydratation puisqu’elle représente le réservoir essentiel des
facteurs d’hydratation naturels (NMF).
II-2-1-4 La couche épineuse (stratum spinosum)
Cette couche est aussi dite « de Malpighi ». Elle est composée de kératinocytes dans
les couches inférieures qui s’aplatissent dans les couches supérieures et qui sont liés les uns
aux autres par des structures, les desmosomes ; les filaments de kératine associés les font
A. Introduction
42
apparaitre hérissés d’épines sur coupe histologique en microscopie optique (d’où le nom de
couche épineuse). Cette couche confère à la peau sa résistance et sa souplesse.
II-2-1-5 La couche basale (stratum germinativum)
Cette couche assure le renouvellement des kératinocytes et contient aussi bien des
cellules souches que des cellules progénitrices des kératinocyes (Fortunel et coll ; 2010). Les
cellules souches sont situées sur la membrane basale sous-jacente. Les kératinocytes sont les
cellules les plus nombreuses de l'épiderme, qui, en se divisant, progressent vers l'extérieur en
se différenciant pour composer les autres couches de l'épiderme. Ils se multiplient de manière
continuelle (10 à 17% des cellules se divisent chaque jour).
II-2-1-6 Principales cellules de l’épiderme
Elle comporte principalement 5 types de cellules :
- les kératinocytes, cités précédemment, se différenciant au fil de leur diffusion et se
chargeant en kératine. Au niveau de la couche cornée, les kératinocytes morts, alors appelés
cornéocytes, sont éliminés par desquamation.
- les mélanocytes situés au fond de l'épiderme, produisant la mélanine, substance responsable
de la couleur de la peau et dont le rôle est de protéger les tissus des effets du soleil.
- les cellules de Langerhans sont produites dans la moelle osseuse puis diffusent vers
l'épiderme où elles s'intercalent entre les kératinocytes sur toute la hauteur de la couche de
Malpighi. Elles assurent un rôle immunologique en contrôlant la présence d'antigènes.
- les cellules de Merkel, dispersées au sein des kératinocytes, sont toujours en contact avec
une terminaison nerveuse. Elles jouent un rôle de mécanorécepteurs et sont impliquées dans la
fonction du toucher.
II-2-2 Le derme
Le derme est un tissu de type conjonctif dont l'épaisseur, de 5 à 9 millimètres, est
variable selon les régions corporelles. Le derme est composé, pour l'essentiel, de fibres de
collagène, de fibres d'élastine et de fibronectine. Il existe trois sortes de fibres élastiques : les
fibres d’élaunine (immatures), les fibres élastiques proprement dites (matures) et les fibres
oxytalanes (Prost-Squarcioni et coll, 2008). Ces Fibres confèrent à la peau son élasticité. Les
fibres de collagènes sont constituées des collagènes I, III et V. Ces derniers sont associés à un
A. Introduction
43
autre type de collagène, dit « FACIT », comprenant les collagènes XIV et XVI. Ces fibres de
collagènes vont conférer au derme sa force de tension.
Cette matrice extracellulaire baigne dans une sorte de gel formé de
glycosaminoglycannes, protéines qui, à la manière d'une éponge, captent l'eau dans le derme
et agissent ainsi comme réservoir d'hydratation. A la différence de l'épiderme, il est
vascularisé, ce qui lui permet non seulement d'apporter à l'épiderme énergie et nutriments
mais aussi de jouer un rôle primordial dans la thermorégulation et la cicatrisation. Il comporte
également de nombreuses fibres nerveuses, des follicules pileux, des glandes sébacées
sécrétant le sébum, des glandes sudoripares ainsi que des cellules du système immunitaire
(lymphocytes, mastocytes, macrophages et autres globules blancs). Le derme s’organise en
deux couches :
II-2-2-1 Derme papillaire
Le derme papillaire ou superficiel est un tissu conjonctif lâche qui s’insinue entre les
crêtes de l’épiderme, formant ainsi les papilles dermiques. Il est composé de collagène de type
I, III et VII et de fines fibres élastiques. Cette matrice est relativement riche en cellules
(fibroblastes, mastocytes et dendrocytes) et sert de support aux fibres nerveuses ainsi qu’aux
capillaires sanguins et lymphatiques qui constituent un véritable tissu nourricier pour
l’épiderme.
II-2-2-2 Derme réticulaire
Le derme réticulaire, plus profond, est un tissu conjonctif plus dense composé d’un
entrecroisement de faisceaux de grosses fibres de collagène et de fibres élastiques présentant
une orientation préférentiellement parallèle à la surface de la peau. Il contient moins de
collagène de type III que le derme papillaire et il se différencie de celui-ci par un tissu
conjonctif dense, principalement constitué de collagène de type I et de fibres d’élastine. Cette
partie du derme contient peu de substance fondamentale et de cellules conjonctives. Le derme
réticulaire héberge aussi les annexes dermo-épidermiques (follicules pileux, glandes sébacées
et sudoripares) ainsi que les cellules endothéliales qui participent à la formation des
vaisseaux. Il contient un important réseau vasculaire assurant la nutrition de l’épiderme et des
nerfs permettant les perceptions.
A. Introduction
44
II-2-3 Hypoderme
L'hypoderme est le compartiment le plus profond et le plus épais de la peau. Il
s'invagine dans le derme et est rattaché au derme sous-jacent par des fibres de collagène et
d'élastine. Il est essentiellement constitué d'un type de cellules spécialisées dans
l'accumulation et le stockage des graisses, les adipocytes. Ces adipocytes de l'hypoderme sont
des cellules regroupées en lobules séparés par du tissu conjonctif. L'hypoderme joue le rôle de
réserve énergétique. Les graisses contenues dans les adipocytes, peuvent être remises en
circulation, via la voie veineuse, lors d'un effort intense ou lors d'une déficience en apport
énergétique, et seront transformées en énergie. L'hypoderme participe, au moins passivement,
à la thermorégulation puisque la graisse est un isolant thermique (skin-science.com).
II-3 Jonction dermo-épidermique
II-3-1-Généralités
La jonction dermo-épidermique est une membrane basale spécialisée. Les membranes
basales sont des membranes de 50 à 100 nm d’épaisseur, composées de complexes protéiques
de la matrice extracellulaire. Elles sont retrouvées sur la face basolatérale de toutes les
monocouches cellulaires d’épithéliums et d’endothéliums du corps. Elles sont observables par
microscopie électronique à transmission (Lebleu et coll, 2007). Les composants des
membranes basales ont étés étudiés, après isolement, à partir de sarcome de souris appelé
EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) (Timpl et coll, 1978). Les 4 composés principaux des
membranes basales sont le collagène de type IV, les laminines, le perlecane et le nidogène/
entactine (figure 15).
A. Introduction
45
Figure 15: Principaux composants et organisation des membranes basales (Kalluri, 2003)
A : la cellule assemble les composés de la membrane basale en unités fonctionnelles (protomères de collagène IV, trimère de laminines, nidogène et perlécane) dans la cellule puis les secrète. B : la polymérisation des laminines initie l’échafaudage de la membrane basale à la surface basolatérale des cellules. C : Ce polymère s’associe au réseau de collagène IV. Les autres polymères s’associent à ces deux réseaux pour organiser une membrane basale fontionnelle.
II-3-2 Structure
La JDE, d’une épaisseur d’environ 100 nm, présente en microscopie électronique 4
zones distinctes de l’épiderme vers le derme :
1) la membrane plasmique des cellules basales de l’épiderme avec, au niveau des
kératinocytes basaux, des structures d’ancrages appelées hémidesmosomes. Elle mesure 7 à 9
nm d’épaisseur (Briggaman, 1975).
A. Introduction
46
2) la lamina lucida, une zone claire aux électrons d’environ 20 à 40 nm d’épaisseur, riche en
laminine 332 et 311.
3) la lamina densa, une zone dense aux électrons ayant approximativement 30 à 60 nm
d’épaisseur, majoritairement constituée de collagène IV, de laminines 511 et 321, de nidogène
et de protéoglycannes, en particulier le perlecane.
4) la zone fibrillaire, située sous la lamina densa avec des filaments d’ancrage constitués de
collagène I, III et VII, des bobines de microfibrilles et des fibres de collagène.
La complexité de la JDE est caractérisée par la présence des complexes d’ancrage qui
lui confèrent une solidité exceptionnelle et une organisation extrêmement spécialisée. Ils sont
constitués par les hémidesmosomes au niveau de la membrane basale des kératinocytes
basaux, des filaments d’ancrage qui s’étendent de la lamina lucida et qui s’insèrent dans la
lamina densa dans le but de fixer les hémidesmosomes à la membrane basale, et des fibrilles
d’ancrage qui se projettent de la lamina densa jusque dans les régions supérieures du derme
papillaire où ils forment une boucle pour se réinsérer au sein de la lamina densa ou s’associer
à d’autres structures du derme, les plaques d’ancrage (Keen et coll, 1987) (figure 16).
La JDE intervient à de nombreux niveaux : c’est un support mécanique pour
l’attachement de l’épiderme au derme par le réseau de collagène IV, via les hémidesmosomes.
Elle contrôle les échanges de produits métaboliques entre ces deux compartiments,
notamment en régulant la perméabilité de la membrane basale. Cette régulation est sous la
dépendance des protéoglycannes qui créent une barrière pour le passage des macromolécules
anioniques. Elle est un réservoir important de facteurs de croissance. Elle est le support des
kératinocytes lors du phénomène de cicatrisation. Elle laisse migrer à travers ses couches
plusieurs types cellulaires lors de processus immunologiques et inflammatoires. Elle joue un
rôle dans l’organisation et la différentiation cellulaire par interactions mutuelles entre les
récepteurs cellulaires et les molécules de la matrice extracellulaire (Masunga, 2006).
A. Introduction
47
Figure 16: Représentation schématique de la jonction dermo-épidermique (Siméon, 1999)
La jonction dermo épidermique contient des complexes d’ancrage constitués des hemidesmosomes des kératinocytes basaux, des filaments d’ancrage traversant la lamina lucida et la lamina densa et de fibres d’ancrage reliant la lamina densa aux plaques d’ancrage du derme papillaire.
Ce sont les kératinocytes dérivant de l’ectoderme et les fibroblastes dérivant du
mésoderme qui synthétisent les composés de la JDE au cours du développement. Ainsi les
protéines de la plaque des hémidesmosomes, les collagènes IV, V et VII, les laminines 332 et
311 et les protéoglycannes à héparane sulfate sont synthétisés par les kératinocytes basaux.
Les fibroblastes du derme papillaire synthétisent le nidogène, les autres laminines de la JDE,
le collagène IV et la fibronectine de la lamina densa, et les collagènes I, III et VII de la région
sous la lamina densa (Burgeson et coll, 1997).
II-3-3 Les principaux composants
La famille des laminines
Les laminines sont les protéines non collagéniques les plus abondantes des membranes
basales. Ce sont des glycoprotéines de grande taille (400 à 900 kDa). Cette famille de
protéines est constituée de 3 sous unités : , et qui s'assemblent pour former une
morphologie en croix. 11 gènes codent pour les 11 chaînes de la famille des laminines (α1–5,
β1–3, and γ1–3). Toutes les chaînes contiennent à leur extrémité carboxy-terminale un large
domaine globulaire G qui est le site majeur d’adhésion de la laminine. Ce domaine est
constitué de cinq résidus basiques (globules LG1 à LG5). Ce module LG appartient à une
A. Introduction
48
superfamille et est également retrouvé dans un grand nombre d’autres protéines de la MEC.
Les laminines ont un rôle très important dans le réseau des membranes basales puisqu’elles
forment, avec le collagène de type IV, l’architecture de base de toutes les membranes basales.
La laminine 332 est celle que l’on retrouve majoritairement dans la jonction dermo-
épidermique. Elle se situe à la base des filaments d’ancrage (Rousselle et coll, 1991). En plus
de la laminine 332, les laminines 311 et 511 sont également présentes dans cette zone
(Aumailley et coll, 1999). La laminine 332 est composée des chaînes α3, β3, et γ2 et mesure
100 nm de long. Elle interagit avec l’intégrine 64, composé transmembranaire des
hémidesmosomes, à travers leur domaine globulaire localisé à l’extrémité carboxy-terminale
de la sous-unité 3. Cette laminine 332 est aussi connue pour se lier au domaine NC1 du
collagène de type VII. De ce fait, l’intégrine 64, un composé des hemidesmosomes (des
kératinocytes de l’épiderme) est connecté au collagène VII qui est un constituant des fibres
d’ancrages localisées dans le derme papillaire, via la molécule de laminine 332.
Les molécules stabilisant les réseaux de collagène IV et de laminines
Le Nidogène (aussi nommé entactine) est une petite glycoprotéine sulfatée de 150 kDa et
que l’on retrouve au niveau de la lamina lucida. Il se fixe aux laminines, à la fibronectine et
au collagène IV. Le Perlecane est un glycosaminoglycanne de 400 kDa. Il se fixe au collagène
IV et à la laminine 111 et confère une charge négative, régulant ainsi la migration de cellules
chargées à travers les membranes basales (Ray et coll, 1996).
La famille des Plakines
2 membres de cette famille ont pour rôle de lier les filaments intermédiaires de kératine
aux hémidesmosomes. Il s’agit de la plectine et de l’antigène de la pemphigoïde bulleuse de
230 kDa BP230 (McMillan et coll, 2003). La plectine à un rôle de liaison des molécules du
cytosquelette entre-elles.
La famille des intégrines
Les intégrines constituent une famille de récepteurs cellulaires des composants de la
MEC. 64 est exprimée au niveau du complexe des hémidesmosomes et elle est le principal
récepteur de la laminine 332 (DiPersion et coll, 2000). Cette liaison est cruciale pour
l’adhésion cellulaire. 21 et 31 sont localisées au niveau de la face latérale des
A. Introduction
49
membranes plasmiques et connectées directement ou non au cytosquelette d’actine, jouant un
rôle dans les interactions cellules-cellules.
La famille des collagènes
BP180, aussi appelé collagène XVII, appartient à la famille des collagènes
transmembranaires qui englobe un groupe de protéines de type collagène agissant à la fois
comme des récepteurs de surface et des composants de la MEC. Il apparaît que BP180 agit
comme une protéine d’ancrage cruciale, connectant les protéines hémidesmosomales intra et
extracellulaires. Deux autres types de collagène sont présents au niveau de la JDE: le
collagène de type VII dont les dimères constituent des fibres d’ancrages stabilisées par des
ponts disulfures ; le collagène de type IV qui est le composant majeur des membranes basales.
A. Introduction
50
III. Le viieii ll ll iissement cutané
Le processus de vieillissement est une conséquence inévitable de la vie. Le
vieillissement cutané apparait comme étant le résultat de deux types de vieillissements
combinés : le vieillissement intrinsèque et le vieillissement extrinsèque (Poljsak et coll, 2012).
Les changements structuraux dus au vieillissement intrinsèque résultent du vieillissement
physiologique et sont génétiquement déterminés. A ce type de vieillissement s’additionne
donc le vieillissement extrinsèque causé par divers facteurs extérieurs tels que l’exposition
solaire, les radiations ionisantes, le stress physique et psychologique, la consommation de
tabac et d’alcool, les habitudes alimentaires, le style de vie, la pollution et les radiations UV.
III-1 Vieillissement extrinsèque
III-1-1 Influence du tabac et de la nicotine
La consommation de tabac provoque une augmentation des MMPs 1 et 3, provoquant
ainsi la dégradation de collagène et une perte de l’équilibre entre la biosynthèse et la
dégradation du tissu conjonctif dermique. Les espèces réactives de l’oxygène (en anglais :
ROS= Reactive Oxygen Species) sont également impliquées dans le vieillissement prématuré
lié au tabac (Morita, 2007). Une diminution de la biosynthèse des collagènes I et III est
également observée ainsi qu’une accumulation de protéoglycannes altérés. Une augmentation
de l’ARNm de la tropoélastine induisant une accumulation de matériel élastique anormale,
appelée élastose, est également observée (Morita et coll, 2009). Des extraits de tabac
induisent l’augmentation de la forme latente du TGF-dans les surnageants de fibroblastes
dermiques cultivés in vitro (Yin et coll, 2003). L’accumulation de cette forme non
fonctionnelle, ainsi que la régulation négative de son récepteur spécifique, conduit à la
diminution de synthèse des protéines de la matrice extracellulaire.
III-1-2 Influence de l’exposition solaire
A partir du spectre des radiations solaires, il a été montré que les UVB (290-320 nm), les
UVA (320-400nm) et les infrarouges A (770-1400 nm) sont capable d’induire le processus de
vieillissement cutané intrinsèque. Les UVB peuvent pénétrer dans l’épiderme tandis que les
A. Introduction
51
UVA pénètrent également dans le derme et les infrarouges A pénètrent en plus dans
l’hypoderme.
Influence des Ultra-violets
L’incidence des changements induits par exposition aux UVs augmente avec l’âge et est
associée avec une accumulation de mutations au sein des cellules cutanées.
Les UVs constituent le facteur de vieillissement extrinsèque majeur. Le procédé est
complexe et les dommages occasionnés sont divers : dommages mitochondriaux, oxydations
protéiques, dommages de l’ADN dus au raccourcissement des télomères, voies de
signalisation initiées par les récepteurs, mais aussi des dommages directes de l’ADN et
apparition de dimères de thymine.
Les voies de signalisations initiées par les récepteurs sont induites par la photoproduction de
ROS. Les ROS vont activer les récepteurs de surface des cytokines et des facteurs de
croissance aussi bien dans les kératinocytes que dans les fibroblastes. Cette activation de
récepteurs va mener à une signalisation intracellulaire à travers la stimulation de kinases qui,
elles-mêmes, induiront ensuite les facteurs de transcription AP-1 et NFκB. L’induction d’AP-
1 aura pour conséquence de diminuer, d’une part, l’expression génique des 2 collagènes
dermiques majeurs: les collagènes I et III et d’augmenter, d’autre part, la synthèse des
métalloprotéinases matricielles dans les fibroblastes et les kératinocytes. NFκB stimule la
transcription des cytokines inflammatoires qui sont impliquées dans l’attraction des
neutrophiles contenant des collagénases neutrophiles qui dégradent le collagène.
Il y a également un lien entre le photo-vieillissement et les dommages mitochondriaux. En
effet, les mutations de l’ADN mitochondrial dû aux UVs semblent médiées via les ROS. De
plus les mitochondries génèrent de façon continuelle des ROS lors de la production d’ATP en
consommant de l’oxygène via la chaîne respiratoire.
Influence des Infra-rouges A (IRA)
Comme les UVs, les infrarouges provoquent une augmentation de MMP-1 in vitro et in
vivo. De plus, une exposition aux infrarouges réduit également l’expression en collagène I. En
effet, les irradiations IRA de la peau sont principalement absorbées par la mitochondrie et
augmentent donc la production intra-mitochondriale de ROS. Ces ROS vont quitter la
mitochondrie et altérer les niveaux intra-cytoplasmiques de calcium, activant alors la voie de
A. Introduction
52
signalisation des MAP kinases, menant alors à des niveaux d’expression élevés de la MMP-1
(Kim et coll, 2006).
III-1-3 Influence de la pollution de l’air
Comme cité précédemment, la peau est une barrière en contact direct avec les polluants
de l’air, ce qui accélère le vieillissement cutané. Des études ont montré que l’ozone était
capable d’induire l’expression de MMP-9 au niveau des peaux de souris, suggérant ainsi un
rôle dans le remodelage matriciel. Une étude épidémiologique récente a montré un lien direct
entre les poussières en suspension dans l’air et l’accélération des principaux signes de
vieillissement de la peau tels que les rides et l’apparition de tâches cutanées. Ce mécanisme
semble être médié par la production de ROS. De plus ces particules sont capables de servir de
transporteurs pour les composés chimiques et les métaux se localisant au niveau de la
mitochondrie menant au vieillissement cutané via les dommages mitochondriaux (Vierkotter
et coll, 2012).
III-2 Vieillissement intrinsèque
III-2-1 Influence des facteurs génétiques
Le vieillissement cellulaire se traduit par un arrêt de réplication de la cellule. Ceci est
appelé « sénescence réplicative » et résulte de dommages à l’ADN apparus au cours du temps.
Elle est induite par une réduction progressive des télomères. Les télomères situés à l’extrémité
des brins d’ADN, participent à la stabilité chromosomique. Les cellules cutanées font partie
des cellules les plus rapides de l’organisme à se diviser. Les dommages de l’ADN
s’accumulent avec l’âge, cette réplication rapide les rend par conséquent plus vulnérables à la
sénescence réplicative.
III-2-2 Influence des variations hormonales
Avec l’âge, on observe un déclin du niveau d’hormones sexuelles que sont l’estrogène,
la téstosterone, le déhydroépiandrostérone (DHAE) et son dérivé sulfaté ainsi que des
hormones de croissance. Ces hormones ont une grande influence sur les cellules cutanées.
Pour les estrogènes par exemple, il a été montré que les femmes ménopausées avaient
un niveau de collagène I et III qui diminuait, ainsi que le ratio collagène III/collagène I en
comparaison des femmes pré-ménopausées. La capacité de la peau à retenir l’eau, grâce,
A. Introduction
53
notamment, aux lipides de la couche cornée, est également diminuée avec le déclin
d’estrogène (Verdier-Sevrain et coll, 2007). Ces hormones se fixent aux récepteurs cellulaires,
activant l’expression de gènes modulant le renouvellement des cellules cutanées. Avec la
diminution du taux d’estrogène, ces cellules cutanées vont se renouveler plus lentement, avec
pour conséquence un amincissement des couches dermiques et épidermiques. La circulation
sanguine diminue également ainsi que la faculté de la peau à maintenir son élasticité (Raine-
fanning et coll, 2003).
III-2-3 Influence du stress oxydatif
L’oxygène est essentiel pour la vie. Les humains, comme tous les aérobies ont besoin
d’O2 car des systèmes enzymatiques tels que la chaîne de transport des électrons nécessitent
de l’O2. Ils ne peuvent tolérer les produits toxiques produits grâce aux défenses anti-
oxydantes. L’oxygène génère des composés, les ROS, car ces entités radicalaires et
moléculaires sont beaucoup plus réactives que l’oxygène qui leur a donné naissance. Ces
ROS incluent les radicaux libres qui sont des espèces chimiques possédant un ou
plusieurs électrons (notés par un point) non appariés sur leur couche externe. La présence d'un
électron célibataire confère à ces molécules, la plupart du temps, une grande instabilité (elles
ne respectent pas la règle de l'octet), ce qui signifie qu'elles ont la possibilité de réagir avec de
nombreux composés dans des processus le plus souvent non spécifiques, et que leur durée de
vie en solution est très courte. Les radicaux libres importants pour la vie sont le radical
hydroxyle (OH•), superoxyde (O2−), l’oxyde nitrique (NO•), thyl (RS•) et peroxyle (RO2•).
Le peroxynitrite (ONOO−), l’acide hypochlorique (HOCl), le péroxide d’hydrogène (H2O2),
l’oxygène singulet (1 O2) et l’ozone (O3) ne sont pas des radicaux libres mais peuvent
facilement mener à des réactions avec les radicaux libres.
Ces ROS tendent à oxyder toutes les molécules alentours telles que l’ADN, les protéines et les
lipides. Cela a pour conséquence une altération des fonctions cellulaires et/ou tissulaires
menant à une instabilité de l’ADN, une dénaturation des protéines et une accumulation de
bioproduits protéiques. Ces réactions d’oxydation sont physiologiquement indispensables
mais peuvent, dans certaines conditions, être également nuisibles car elles peuvent altérer les
tissus, contribuer à leur sénescence et au développement de certaines pathologies comme les
cancers, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives (Barouki ; 2006).
Pour prévenir les effets délétères dûs à ces composés, les organismes vivants ont développé
un système antioxydant de défense très sophistiqué (enzymes et molécules anti-oxydantes,
A. Introduction
54
enzymes de réparation de l’ADN, protéinases, phospholipases et acyltransférases) qui, dans
certaines conditions extrêmes, peut se trouver débordé. On parle de stress oxydant ou stress
oxydatif lorsque se produit un déséquilibre en faveur d’un excès de molécules pro-oxydantes
avec des effets délétères sur l’organisme par rapport à l’activité des systèmes de défense anti-
oxydante.
Les radicaux libres peuvent être formés de plusieurs façons, la source la plus abondante étant
la mitochondrie puis qu’elle utilise 90% de l’oxygène utilisé par le corps humain. C’est à cet
endroit que l’oxygène est réduit, par différentes étapes séquentielles, afin de produire de l’eau.
Cela provoque la formation de plusieurs intermédiaires non stables tels que l’anion
superoxyde (O2 -), le peroxide d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (.OH) (Wickens,
2001) (figure 17).
Figure 17: Origine des espèces réactives de l’oxygène (Oresajo et coll, 2012)
La réduction de l'oxygène en eau nécessite l'apport de 4 électrons qui peuvent s'additionner un par un, successivement sur O2 en conduisant aux intermédiaires respectifs O2, H2O2 et OH. (e
-)
électron, (H + ) proton, (SOD) superoxyde dismutase, (O2
-) anion superoxyde, (H2O2) peroxyde
d’hydrogène.
Denham Harman fût le premier à associer les radicaux libres avec le concept de
vieillissement. En 1956, il établit une connexion entre des données montrant que l'irradiation
de systèmes vivants provoquait des mutations, l’apparition de cancer et le vieillissement par la
production de radicaux libres et des données montrant que les radicaux libres étaient produits
normalement dans des tissus vivants. En 1972, il émit l’hypothèse que la mitochondrie aurait
un rôle dans le vieillissement. Il a basé cette théorie sur le fait qu’il y avait une étroite
proximité entre les espèces oxygénées produites par les sous-produits de la respiration et
l’ADN mitochondrial dans l’espace inférieur de la membrane de celle-ci. Un autre facteur pris
en compte est l'inefficacité relative des mécanismes de réparation dans la mitochondrie et le
fait que le génome mitochondrial n'est pas protégé par des histones comme le génome
A. Introduction
55
nucléaire. Cela laisse donc suggérer que l’ADN mitochondrial serait une cible privilégiée
pour les espèces réactives de l’oxygène produites par la mitochondrie (Joao et coll., 2005).
Le peroxyde d’hydrogène est aussi toxique pour les cellules et provoque une nouvelle
génération de radicaux libres, particulièrement lors de sa réaction avec des métaux réduits des
radicaux hydroxyles. Pour pallier à ce stress oxydatif, la peau est équipée d’un réseau de
systèmes anti-oxydants. L’acide ascorbique, l’acide urique, l’-tocopherol et le glutathion
sont les molécules anti-oxydantes non enzymatiques les mieux connues. Il existe également
des anti-oxydants enzymatiques comme la glutathion-peroxidase (GPx), la glutathion-
réductase, la superoxyde dismutase (SOD) et la catalase (CAT) dans l’épiderme. La SOD
convertit les anions superoxyde en peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui sera alors dégradé en
eau sous l’action de la CAT. Cependant, l’efficacité de ces systèmes de protection semble
diminuer avec l’âge, indiquant donc que la génération de radicaux libres et le déclin des
défenses anti-oxydantes qui lui sont couplées sont considérés comme des contributeurs
potentiellement importants du vieillissement cutané.
Ce stress oxydatif, bien que décrit ici dans les processus de vieillissement intrinsèque,
provient également lors du vieillissement extrinsèque. En effet, la peau humaine est
constamment exposée directement à l’air, aux radiations solaires, aux polluants
environnementaux, et à d’autres agressions chimiques et mécaniques capable d’induire la
génération de radicaux libres et de ROS de notre métabolisme. Parmi les facteurs provoquant
le vieillissement extrinsèque, ce sont les radiations UV qui sont responsables de plus de 80%
de la génération de ROS.
A. Introduction
56
IV. La sénescence
La sénescence cellulaire (du mot latin senex, signifiant vieil âge ou vieil homme) est
considérée comme l’incapacité de la cellule à se diviser.
Quel que soit le stimulus qui la déclenche, la sénescence signifie, et c’est ce qui la différencie
de la quiescence, qu’il se produit un arrêt du cycle cellulaire. Les cellules quiescentes (par
exemple des cellules qui ont arrêté de proliférer en réponse à un sevrage en facteur de
croissance ou à une inhibition de contact) reprennent leur prolifération en réponse à un signal
mitogène alors que les cellules sénescentes ne peuvent être stimulées par aucun des stimuli
physiologiques connus.
IV-1 Evolution du concept de sénescence
Au début des années 1960, Leonard Hayflick a montré que les cultures primaires de
fibroblastes humains de tissus embryonnaires de poumon cessaient de proliférer après un
nombre limité de doublement de population (DP 50 ± 10).
L’évolution de la culture cellulaire peut se diviser en trois phases : la phase I se situe entre la
mise en culture d’un explant de peau humaine et l’établissement d’une culture primaire; la
phase II constitue une phase de prolifération exponentielle de cellules dites « jeunes ». Un
ralentissement de la division cellulaire mène ensuite à la phase III : la sénescence réplicative
(figure 18). A ce stade, l’arrêt des mitoses est irréversible. Cependant, les cellules dites «
vieilles » (Hayflick and Moorhead, 1961), peuvent rester métaboliquement actives pendant
plusieurs mois, voire plusieurs années avant de mourir par nécrose. Ceci mime les processus
ayant lieu lors du vieillissement normal de l’organisme (Chretien et coll., 2008)
A. Introduction
57
Figure 18: Evolution de la durée de vie des fibroblastes en culture (Shay et Wright, 2000)
La phase I correspond à la culture primaire, la phase II représente les cellules subcultivées pendant leur période de réplication exponentielle. La phase III représente la période durant laquelle la réplication cellulaire cesse tandis que le métabolisme continu.
La perte du potentiel de division cellulaire et les changements morphologiques des
fibroblastes de poumons et de peau ont d’abord été proposés comme modèles pour l’étude du
vieillissement à l’échelle cellulaire. Plus tard, ce que Hayflick avait décrit comme du
« vieillissement cellulaire » s’est trouvé être approprié pour comprendre les évènements qui
suivent l’activation oncogénique et mènent à la transformation cellulaire. En plus de refléter
la perte de l’homéostasie des tissus normaux comme une conséquence du vieillissement, la
sénescence cellulaire est également connue pour être un mécanisme suppresseur de tumeurs.
IV-2 la sénescence réplicative
Ce phénomène de « sénescence réplicative » est à distinguer de l’apoptose ou de la
nécrose puisque ce n’est pas de la mort cellulaire (Kipling, 2001). Cette sénescence
réplicative semble résulter de la perte progressive des répétitions télomériques aux extrémités
des chromosomes.
Comment la sénescence réplicative contribue-t-elle au vieillissement humain ? Il y a deux
voies connues. La première est le simple modèle d’épuisement des capacités de division. Pour
de nombreux organes, la division cellulaire fait partie intégrante des fonctions tissulaires. En
effet, la réduction du nombre de cellules fonctionnelles liée au ralentissement des divisions
cellulaires peut avoir de sérieux impacts sur la fonction des organes. L’autre voie par laquelle
la sénescence réplicative peut contribuer à l’altération des fonctions tissulaires est une
A. Introduction
58
modification de l’expression protéique des cellules (comme une surexpression de la
collagénase par les fibroblastes dermiques). Nous évoquerons dans les prochains paragraphes
les différentes caractéristiques des cellules sénescentes.
IV-2-1 Phénotype sénescent
Bien que la caractéristique principale de la sénescence réplicative soit la perte de
réponse aux stimulis mitogènes, le « phénotype sénescent » est aussi caractérisé par des
altérations de leurs propriétés de croissance, de morphologie ainsi que d’un dérèglement
général de processus hautement régulés. La morphologie des fibroblastes vers la fin de leur
vie réplicative est principalement caractérisée par des cellules élargies avec une augmentation
de la taille de leur noyau et de leurs nucléoles mais aussi une augmentation du nombre des
lysosomes et des appareils de golgi. Il y a une apparition de vacuoles dans le cytoplasme et
dans le réticulum endoplasmique et une augmentation des microfilaments cytoplasmiques. En
plus de ces changements morphologiques, les populations de cellules sénescentes exhibent
une augmentation du nombre de cellules multinuclées. Les fibroblastes sénescents expriment
des niveaux élevés de protéases dégradants la matrice extracellulaire ainsi que le tissu
activateur du plasminogène (t-PA) et les membres de la famille des métalloprotéinases
matricielles (MMP). L‘expression des inhibiteurs de protéases TIMP1 et MIG-5 décroît ainsi
que l’expression de certains composants de la matrice extracellulaire tels que l’élastine, la
laminine et quelques formes de collagènes (Cristofalo et coll., 2004). Il y a également
apparition d’une délétion caractéristique de 4977 pb de l’ADN mitochondrial.
A chaque division cellulaire, il y a un raccourcissement télomérique qui n’aura pas
d’incidence sur la cellule qui continuera donc à fonctionner normalement. Cependant, quand
les chromosomes deviendront trop courts, les télomères enverront un signal d’arrêt de la
prolifération cellulaire (Xu et coll, 2013).
IV-2-2 Morphologie cellulaire
Klaus Bayreuther a montré que les fibroblastes de peau humains maintenus en culture
se différencient spontanément selon 7 stades appelés morphotypes. Au cours des doublements
de population en culture, les fibroblastes progressent des morphotypes mitotiques (F I, F II et
F III) vers les morphotypes post-mitotiques (PMF IV, PMF V, PMF VI et PMF VII) (figure
19). Les F I sont des petites cellules fusiformes et effilées ; les F II sont des petites cellules de
formes irrégulières et les F III sont de plus larges cellules de forme épithélioïdes irrégulières.
A. Introduction
59
Les F IV sont de grandes cellules fusiformes ; les F V sont arrondis et de très grande taille; les
F VI sont les cellules les plus larges et les F VII présentent une morphologie caractéristique
de cellules en dégénérescence qui se détachent de leur support (Bayreuther et coll., 1998).
Figure 19: Morphotypedes fibroblastes. (A) F I. (B) F II. (C) F III. (D) F IV. (E) F V. (F) F VI. (G) F VII. (x 86.)(Bayreuther et coll,,1998)
Les MFI, MFII et MFIII sont mitotiques tandis que les PMFIV, PMFV, PMFVI sont post-mitotiques.
IV-2-3 La SA -gal (senescence associated beta-galactosidase)
La β-galactosidase est une enzyme lysosomale capable d’hydrolyser des -
galactosides en monosaccharides. Son activité optimale est observée à pH acide (pH 4,0 –
5,0), proche du pH lysosomal. La β-galactosidase peut cliver le substrat chromogénique 5-
bromo-4-chloro-3-indolyl β-galactopyranoside (x-gal) et donner une coloration bleue aux
cellules. En 1995 Dimri proposa l’existence de la senescence associated beta-galactosidase
lorsqu’il observa que seules les cellules sénescentes présentaient une coloration bleue à pH
6.0 lors du clivage de la X-Gal. Il proposa aussi que cette SA β-Gal était une enzyme distincte
de la gal lysosomale (Dimri et coll., 1995) (figure 20).
A. Introduction
60
Figure 20: Action de la -galactosidase sur un galactoside
La -galactosidase est une hydrolase dont le rôle est d’hydrolyser des -galactosides en monosaccharides.
Un article de Zang et Hu a montré 3 points importants au sujet de cette enzyme : la
coloration SA -Gal augmente avec l’âge réplicatif mais aussi dans les cellules quiescentes et
les cellules privées de sérum. L’augmentation est irréversible en réponse à la sénescence ou
au peroxyde d’hydrogène mais est complétement réversible sous d’autres conditions. Ils ont
montré que la SA -Gal n’est pas une enzyme spécifique mais l’enzyme lysosomale mesurée
à pH suboptimal de 6,0 (Yang et coll., 2005).
IV-2-4 Délétion de l’ADN mitochondrial
Les mitochondries possèdent leur propre matériel génétique codé par un ADN
circulaire double brin d’environ 16,5 kb. Au cours du vieillissement, des délétions, mutations
ou modifications des nucléotides altèrent le génome mitochondrial. La délétion la plus
commune est une délétion de 4,9 kb et il a été démontré que la fréquence d’apparition de cette
délétion augmente lors du vieillissement de la peau in vivo (Pang et coll, 1994) (lee et coll,
1997).
IV-2-5 Les gènes associés à la sénescence
Plusieurs études différentes ont démontré que les fibroblastes en sénescence
réplicative présentent des modifications au niveau de l’expression de nombreux gènes. Ces
études ont montré des modifications de l’expression de gènes impliqués dans l’inflammation,
la régulation du cycle cellulaire, le cytosquelette et dans le métabolisme (tableau 1). Suite à
une étude basée sur la technique de l’hybridation soustractive, l’équipe de Gonos a mis en
évidence des gènes dont l’expression est augmentée en sénescence réplicative, comme par
exemple l’apolipoprotéine J (apo J), la fibronectine, la protéine SM22 (Smooth Muscle 22), et
l’ostéonectine (Gonos et coll, 1998). L’apo J est une protéine chaperonne qui est surexprimée
A. Introduction
61
dans de nombreuses situations telles qu’un stress, une blessure ou pendant le développement.
De plus, elle octroie une protection aux fibroblastes contre la sénescence induite
prématurément par des stress sublétaux au t-BHP ou à l’éthanol (Dumont et al, 2002). Il est
également bien établi que l’expression de certaines protéines matricielles est modifiée lors du
vieillissement, par exemple, le collagène I diminue (Uitto, 2008) (Oikarinen, 1994) et une
augmentation de certaines MMPs telle que la MMP-1 est également observée (Xia et coll,
2013).
Tableau 1 : Comparaison de la différence d’expression de gènes d’intérêts de fibroblastes jeunes et âgés (De Magalhaes et coll, 2004)
A. Introduction
62
IV-2-6 Raccourcissement des télomères
Dès 1971, le biologiste russe Olovnikov fit une proposition audacieuse qui se révéla
prémonitoire. D'après lui, les molécules linéaires d'ADN ne peuvent pas être répliquées
jusqu'au bout. À chaque réplication, elles perdent quelques bases. L'érosion des télomères est
appelée télotomie. On peut comparer le chromosome à un sablier qui perdrait une partie de
son contenu lors de chaque mitose. Quand tout le sable s'est écoulé, la cellule devient
sénescente.
En 2009, le prix Nobel de Physiologie et médecine fut attribué aux Docteurs Blackburn,
Greider and Szostak pour leur découverte de la protection des chromosomes par les télomères
et la télomérase au cours de la réplication de l’ADN.
En bref, comme la machinerie de réplication de l’ADN nécessite un point d’attachement
initial au brin d’ADN, de petits composés terminaux de l’ADN en cours de réplication ne
peuvent pas être synthétisés au cours de la division cellulaire (Kovacic et coll, 2011). De ce
fait, le matériel génétique serait perdu à chaque division cellulaire.
Les télomères sont des séquences nucléotidiques répétitives 5′-TTAGGG-3′ aux extrémités
des chromosomes. Ces longues étendues de séquences double brins d’ADN sont suivies par
des répétitions simple brin riche en G (et dépourvu de C), encore appelé brins G, qui forment
une extrémité simple brin 3’ sortante dont la longueur est estimée de 130 à 210 bases chez
l’Homme. Cette extrémité peut envahir la partie double brin pour former une structure en
lasso appelée boucle-t (t-loop). L’extrémité 3’ sortante est alors appariée avec le brin C et
déplace le brin G en une boucle de déplacement (D-loop). Cette configuration particulière
pourrait participer à la protection des extrémités chromosomiques en masquant la terminaison
du télomère.
Un complexe de 6 protéines (TRF1 (Telomeric Repeat Binding Factor 1), TRF2 (Telomeric
Repeat Binding Factor 2), POT1 (Protection Of Telomere 1), TIN2 (TRF1 Interacting factor
2), TPP1 (TriPeptidyl Peptidase 1) et RAP1 (Repressor Activator Protein 1) peut se lier à
l’ADN télomérique double brin ou à l’extrémité 3’ sortante simple brin forment le complexe
télosome ou shelterin et fournit une protection de l’extrémité des chromosomes (figure 21).
Le télosome intervient dans la formation de la boucle-t, dans la régulation de la longueur des
télomères par la télomérase et dans la protection des extrémités télomériques contre les
systèmes de signalisation et de réparation des dommages à l’ADN. Les fibroblastes humains
perdent 50-100 pb à chaque raccourcissement télomérique.
A. Introduction
63
Il a été suggéré que cette perte des répétitions télomériques est reconnue comme un dommage
des doubles brins d’ADN et induit une réponse « check point ». Des études ont montrées
qu’un foci de dommages à l’ADN apparait au niveau des télomères des cellules sénescentes.
Ce foci contient de nombreuses protéines de dommages à l’ADN telles que γ-H2AX, 53BP1,
MDC1, NBS1, MRE11 et RAD17.
Figure 21: Structure des télomères et apparence microscopique (adapté de Young, 2010)
A : Les télomères sont situés à l’extrémité des chromosomes, ils sont composés de centaines de milliers de séquences d’ADN répétitives TTAGGG. Des protéines protectrices sont associées aux télomères (TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1, et RAP1). Les télomères de l’extrémité simple brin 3’ envahissent l’hélice double brin formant alors la boucle t. B : les télomères peuvent être visualisés au microscope à la fin de la phase M en fluorescence grâce à la technique d’hybridation in situ.
IV-2-7 Arrêt irréversible du cycle cellulaire
L’une des cibles des voies de réparation des dommages à l’ADN est le facteur de
transcription p53. C’est une protéine clé du processus de sénescence car elle fait le lien entre
la voie de détection des dommages et les protéines de régulation du cycle cellulaire. Une fois
A. Introduction
64
activé, p53 induit l’expression de l’inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines p21WAF-1.
L’expression de p21WAF-1 a pour conséquence la capture et l’inhibition d’un autre facteur de
transcription : E2F1. L’expression des gènes cibles d’E2F1 est nécessaire pour la progression
des cellules en phase S du cycle cellulaire. Ainsi, l’inactivation d’E2F1 entraîne un arrêt des
cellules au niveau de la transition G1-S, caractéristique des cellules sénescentes (figure 22).
Figure 22: Cycle cellulaire et implication des CDKI (Dehay et Kennedy, 2007) Le cycle cellulaire eukaryote comporte 4 phases successives : la phase M (mitose) dans laquelle le noyau et le cytoplasme se divisent ; la phase S (synthèse d’ADN) dans laquelle l’ADN nucléaire est répliqué ; la phase G1 impliquée dans le contrôle de l‘intégrité de l’ADN avant de passer à sa réplication. Entre la phase S et M se situe la phase G2 dans laquelle la cellule vérifie la conformité de l’ADN répliqué avant de passer à la division cellulaire. La transition d’une phase à l’autre est sous le contrôle des complexes cyclines/CDK. L’activité des CDK est régulée par l’action de deux familles de protéines inhibitrices : la famille INK4 et la famille CIP/KIP.
IV-2-8 Voies de signalisations impliquées
La voie de signalisation induisant la sénescence commence donc par l’activation de la
voie de dommages à l’ADN (figure 23).
A. Introduction
65
Figure 23: Voie de signalisation de la réponse aux dommages à l’ADN (Nature, 2007)
La voie ATR-Chk1 répond principalement aux blocages des fourches de réplication et aux lésions produites par les rayons ultraviolets alors que la voie ATM-Chk2 répond aux cassures double-brin de l’ADN. Ces deux voies induisent un arrêt du cycle cellulaire via une inhibition des complexes cyclines/CDK, soit par activation de p53, soit par inhibition de cdc25.
3 protéines identiques au (phosphatidylinositol 3-kinase) sont connues comme étant
les premières transductrices de signaux de dommages à l’ADN. La voie ATR-Chk1 répond
principalement aux blocages des fourches de réplication et aux lésions produites par les
rayons ultraviolets alors que la voie ATM-Chk2 répond aux cassures double-brin de l’ADN
causées par les radiations ionisantes et le stress oxydatif (Herbig, 2004).
Ceci va induire une activation via la phosphorylation des protéines kinases Chk1 et Chk2 (cell
cycle checkpoint kinase 1 et 2) qui vont activer la protéine p53, activant elle-même p21WAF-1.
Ces deux protéines sont appelées « suppresseurs de tumeurs » puisqu’elles participent au
blocage du cycle cellulaire lorsque des dommages à l’ADN sont détectés. Une augmentation
de la protéine p16INK-4a, un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines, est également
observée. Cependant, si p53 module de façon directe et positive l’expression de p21WAF-1, il
s’avère que le mécanisme qui régule p16INK-4a n’est que partiellement élucidé. Des études ont
montré que les ADN télomériques simples brins et riche en G induisent un arrêt du cycle
dépendant de p53 qui devient stable si les cellules ne répondent pas par l’activation de la
télomérase. Un arrêt transitoire est induit dans des cellules tumorales positives pour p53 mais
négatives pour p16 INK-4a, laissant supposer que la première cible du signal de sénescence
A. Introduction
66
réplicative est la voie p53/p21WAF-1 (Saretzki et coll, 1999) (figure 24). p21WAF-1 et p16INK-4a
participent ensuite à l’hypophosphorylation de Rb (protéine du rétinoblastome), qui va alors
inhiber l’action du facteur de transcription E2F, et réprimer la transcription de gènes
permettant la progression du cycle cellulaire comme les cyclines A, B et E. La progression du
cycle cellulaire est donc bloquée. L’inhibition de E2F dans les cellules sénescentes est
associée à des changements d’architecture chromatinienne caractérisés par des ponctuations
multiples de l’ADN appelées SAHF (pour foyers d’hétérochromatine associés à la
sénescence). La formation de ces foyers dépend de l’état fonctionnel du gène Rb.
Figure 24: Mécanisme à la base de l’arrêt permanent du cycle cellulaire à la base de la sénescence (Gire,2005)
Divers stimulus peuvent activer un programme commun de sénescence. Le raccourcissement des télomères est le stimulus physiologique le mieux décrit dans l’induction de la sénescence. L’expression d’oncogènes activés peut également déclencher la sénescence et constituerait un mécanisme suppresseur de tumeur. Le programme effecteur de la sénescence comprend les voies p53/p21WAF1 et p16 INK4a/pRb. p53 serait activée par les kinases ATM/Chk2 (médiateurs des systèmes de réparation des dommages de l’ADN) ou par p19ARF (médiateur de la voie signalétique activée par ras oncogénique chez la souris). Le facteur p16INK4a serait activé par le stress imposé par des conditions inadéquates de culture et par une stimulation oncogénique déréglée. Les mécanismes responsables de l’accumulation de p16INK4a sont encore méconnus.
A. Introduction
67
D’autres études ont montré que lors du stress oxydatif, p16INK-4 était activée,
probablement sous l’action de la protéine p38-MAPK, un membre de la famille des protéines
kinases activées par le stress (Ben-Porath, 2005).
IV-2-9 Rôle de la sénescence dans le vieillissement
Comment le vieillissement des cellules peut-il jouer un rôle dans le vieillissement de
l’organisme entier ? 2 voies sont possibles :
l’accumulation de cellules sénescentes, qui ne peuvent donc plus se diviser, induit une
diminution du renouvellement cellulaire de l’organisme, et par conséquent du
renouvellement tissulaire.
les cellules sénescentes présentent une augmentation de la sécrétion des MMPs, de
cytokines inflammatoires ainsi que de certains facteurs de croissance, provoquant alors
des inflammations locales, des ruptures de tissus et des environnements plus propices à la
croissance néoplasique.
Ces deux phénomènes provoquent un déclin des fonctions tissulaires et participent ainsi au
vieillissement de l’organisme entier (figure 25)
Figure 25: Les 2 voies possibles par lesquelles les cellules sénescentes pourraient contribuer au processus de vieillissement (Chen et coll., 2007).
A : la sénescence réduirait l’auto-renouvellement cellulaire, causant une régénération imparfaite des tissus. B : la sénescence cellulaire pourrait induire des structures tissulaires dégradées, des inflammations locales et un micro-environnement permissif à la croissance néoplasique à travers la sécrétion d’enzymes de dégradation, de cytokines inflammatoires et de facteurs de croissance. Ces deux voies compromettent l’homéostasie des tissus ainsi que leurs fonctions menant alors au processus de vieillissement.
A. Introduction
68
IV-3 La sénescence accélérée induite par le stress
Ce processus, contraste avec l’induction de la sénescence au cours des divisions
cellulaires ; ce processus est désigné par le terme de sénescence prématurée induite par le
stress (SIPS). Le fait que les différents types de stress soient potentiellement tumorigènes a
fait naître l’idée que la sénescence est un mécanisme majeur d’inhibition de la prolifération
dans des cellules normales exposées à un risque de transformation (Bischof et coll., 2009). La
surexpression d’oncogènes, comme les formes activées de RAS ou RAF, peut induire un arrêt
du cycle similaire à celui observé lors de la sénescence dans des cellules primaires humaines
et murines. Ce mécanisme est dépendant de la protéine p16INK-4a. La modification de la
chromatine vers une structure plus condensée, en inhibant les histones désacétylases, induit
également un phénotype identique à la sénescence. Certains stress causant des dommages à
l’ADN provoquent des arrêts de croissance cellulaire: divers types de radiations, des
médicaments induisant des cassures de l’ADN double brin et différentes voies générant des
stress oxydatifs comme un traitement au peroxyde d’hydrogène (Frippiat et coll., 2001) ou au
butylhydroperoxyde (t-BHP). Cela prouve que l’arrêt de prolifération peut être induit presque
immédiatement par un stress intense ou plus lentement par des traitements chroniques ou
semi-chroniques.
IV-3-1 stress aïgu sublétal : sénescence accélérée induite par le stress
oxydatif
D’un point de vue expérimental, ce stress est celui qui est le plus utilisé pour induire
une « sénescence accélérée induite par le stress ». En effet un stress oxydatif subléthal induit
une sénescence prématurée dans de nombreux types cellulaires aussi bien par traitement
chronique que par traitement unique avec des doses hyperoxiques. Parmi les autres stress
aïgus on retrouve les traitements avec des doses sublétales d’éthanol, de t-BHP, ou
l’exposition à des doses sublétales d’UVB .Cela réduit considérablement le taux de
croissance, qui est lui-même dépendant des capacités antioxydantes de la cellule traitée
(Toussaint et coll., 2000). La plupart des biomarqueurs de la sénescence réplicative
apparaissent dans ces conditions comme : une morphologie identique à la sénescence, une
absence de réponse aux stimuli mitogéniques, une augmentation des proportions de cellules
positives pour la SA -gal et biensur un arrêt irréversible du cycle cellulaire
A. Introduction
69
IV-3-1-1 Voies de signalisation impliquées dans la sénescence accélérée
induite par H202
Comme cité précédemment, le stress oxydatif, en plus d’activer la voie p53 et p21 WAF-
1 « classique », va activer également p16INK-4 , probablement sous l’action de la protéine p38-
MAPK (figure 26).
Figure 26: Activation de la senescence par divers stimulis (Thorin-Trescases et coll, 2010) La sénescence peut survenir selon deux voies majeures, la sénescence réplicative et la sénescence induite par le stress (SIPS). La sénescence réplicative conduit à l’érosion progressive des télomères jusqu’à un seuil critique où les télomères deviennent dysfonctionnels. Ceci active des protéines telles qu’ATM qui induit la phosphorylation de H2AX, un marqueur de dommage à l’ADN. De nombreuses protéines sont alors activées pour propager ce signal de dommage, dont p53, une protéine dite suppresseur de tumeurs. Celle-ci joue un rôle clé en activant p21, une protéine inhibitrice du cycle cellulaire qui empêche la phosphorylation de Rb et bloque ainsi la prolifération cellulaire. La sénescence induite par le stress, découle, entre autres, de l’activation de la voie p53-pRb. Un autre inhibiteur de cycline, p16, serait un intermédiaire potentiel. Ces différentes voies peuvent se croiser, puisque le stress oxydant peut directement endommager les télomères, et varier selon les types cellulaires. MAPK : mitogen activated protein kinase ; ATM : ataxia telangiectasia muté ; H2AX : histone de type H2AX ; pRb : protéine rétinoblastome phosphorylée.
Une surexpression de p21WAF-1 est observée après traitement à des doses subtoxiques
déjà définies de peroxyde d’hydrogène. p21WAF-1 inhibe l’activité du complexe cycline
D/kinases dépendantes des cyclines 4 et 6 (cdk 4 et 6) menant à l’hypophosphorylation de Rb.
La protéine p53 augmente juste après le stress, puis revient à son niveau de base.
A. Introduction
70
Le niveau de phosphorylation de la protéine de rétinoblastome (Rb) dépend de l’activité
kinase des complexes cyclines/CDK. Rb doit être hyperphosphorylée pour que les cellules
puissent entrer en phase S du cycle cellulaire. Les cellules sénescentes stimulées avec des
facteurs de croissances ne présenteront pas de phosphorylation de Rb. Un très faible niveau de
phosphorylation de Rb est observé pendant plusieurs semaines suivant le traitement au
peroxyde d’hydrogène. Une étude a montré que CdK2 diminuait, tant au niveau protéique que
génique, 72h après l’induction du stress par H202, ce qui suggère que l’hypophosphorylation
de Rb est aussi partiellement dûe à la diminution de cette kinase et que cet effet médié par
CdK2 doit être un mécanisme additionnel à l’inhibition du complexe cycline D/ CdK4 et 6
médié par p21WAF-1 (Frippiat et coll., 2003). Les fibroblastes traités au peroxyde d’hydrogène
sont bloqués principalement en phase G1 du cycle cellulaire (comme les cellules sénescentes).
Au niveau des fibroblastes sénescents, le niveau de p21WAF-1 retourne à la normale tandis que
la quantité de la CDKI p16INK-4a est durablement élevée, tant au niveau génique que protéique
(Kiyono et coll., 1998).
Les facteurs de croissances induisent la transcription de l’ARNm de c-fos dans des
fibroblastes humains quiescents alors que cette induction disparait dans les fibroblastes
sénescents. Après activation, le facteur de transcription AP-1 induit la transcription de gènes
nécessaires pour entrer en phase S. Les fibroblastes traités au peroxyde d’hydrogène
présentent un faible niveau génique de c-fos comparé à des cellules non traitées. Ce faible
niveau de c-fos participe à l’arrêt irréversible du cycle cellulaire.
IV-3-1-2 Expression des gènes associés à la sénescence par les fibroblastes dermiques
humains traités avec H202
De nombreux gènes relatifs à la sénescence sont surexprimés 3 jours après le
traitement au peroxyde d’hydrogène. Plusieurs études différentes ont démontré que les
fibroblastes en sénescence accélérée présentent des modifications au niveau de l’expression
de nombreux gènes. La MMP-1 et la SM22 sont surrexprimées aussi bien au cours de la
sénescence réplicative que lors de la sénescence induite par H202. L’interferon-gamma (IFN-
) est connu pour être impliqué dans la régulation de gènes spécifiques de la sénescence et est
aussi surexprimé. L’expression d’autres gènes associés à la sénescence (comme la diminution
du collagène I et la surexpression de la stanniocalcine) est modifiée de manière identique lors
de la sénescence réplicative et de l’induction de la sénescence par traitement avec H202
(Saretzki et coll., 1998). De plus l’expression génique de régulateurs clés du cycle cellulaire
A. Introduction
71
est modifiée lors d’un traitement avec H2O2 : une augmentation génique des p21WAF-1 et
p16INK-4a est observée (comme expliqué dans le paragraphe ci-dessus) et une diminution de
p27KIP-1 et de p19INK-4D (Frippiat et coll, 2000). L’expression de nombreux autres gènes est
modifiée lors de la sénescence prématurée induite par H2O2 (tableau 2).
Tableau 2: Modification de l’expression de gènes lors de la sénescence prématurée induite par H2O2 (Magalhaes et coll, 2004)
IV-3-2 Stress chronique sublétale: sénescence accélérée induite par le stress
au NaCl
Parmi les stress chroniques induisant la sénescence prématurée des fibroblastes
dermiques, on retrouve un traitement avec 40% d’O2 (hyperoxie sublétale) (Von Zglinicki et
coll, 1995) ou avec de fortes concentrations en NaCl. En effet, des études ont montré que de
A. Introduction
72
fortes concentrations en NaCl provoquaient des cassures de l’ADN des cellules médullaires
de souris, induisant alors la sénescence par induction de la voie de réparation des dommages à
l’ADN (Dmitrieva et coll, 2003).
73
B. But de l’étude
B. But de l’étude
74
Le vieillissement cutané est généralement associé à un épaississement des membranes
basales. Des études préliminaires réalisées par Vazquez et collaborateurs (1996) mettent en
évidence une augmentation d’épaisseur de la membrane basale épithéliale chez des sujets âgés
de plus de 35 ans alors que le collagène IV tend à décroître dans les mêmes conditions.
Les objectifs de cette étude sont :
de rechercher si le vieillissement cutané s’accompagne effectivement de la diminution
du collagène IV, en caractérisant le niveau d’expression de ses chaînes
polypeptidiques constitutives.
d’isoler les fibroblastes à partir de biopsies de peau provenant de sujets jeunes ou âgés
et examiner la part de ce type cellulaire dans la production des diverses chaînes
polypeptidiques constitutives du collagène IV au cours du vieillissement.
de déterminer si la diminution d’expression au cours du vieillissement chronologique
résulte d’une inhibition d’expression des gènes codant pour les chaînes (IV).
De déterminer le mécanisme impliqué et sa régulation possible afin de proposer, à
terme, de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de restaurer l’intégrité de la
membrane basale.
75
C. Matériel et Méthodes
C. Matériels et Méthodes
76
I.Matériiells et réactiifs utii ll iisés
L’ensemble du matériel et des réactifs utilisés lors des différentes expériences, ainsi que leur
provenance, est répertorié dans les tableaux ci-dessous (liste alphabétique).
Matériel Utilisation Fournisseurs Appareil 2100 Bioanalyseur Puces à ARN Agilent technologies
Appareil Chemidoc Western-blot (Révélation) Bio-Rad
Appareil de comptage cellulaire Mesure de viabilité cellulaire Invitrogen
Appareil photo Acquisition d’images Canon
Appareil stratagene Mx300SP PCR temps réel Agilent technologies
Capillaires LightCycler® PCR temps réel Roche
Cellulose DE52 - papier absorbant Western-blot (transfert) Whatman
Centrifugeuse 5810 R centrifugation Eppendorf
Centrifugeuse 5415 R centrifugation Eppendorf
Concentrateurs de milieux-vivaspin Concentration protéique Sartorius
Countess Compteur de cellules Invitrogen
Cuve Mini-PROTEAN II Electrophorèse Bio-Rad
Filtres à usage unique 0,2 µM Filtration D. Dutscher
Flacons de culture 25 cm2 Culture cellulaire Falcon
Flacons de culture 75 cm2 Culture cellulaire Falcon
Hotte à flux laminaire MS 12 Culture cellulaire Jouan
Incubateur Culture cellulaire Jouan
Lames de verre ®- Superfrost immunomarquages Thermo scientific
Lamelles de verre ronde 12 mm Culture cellulaire VWR
Lecteur de microplaques UVM 340 Spectrophotométrie Asys
Logiciel d’analyse ImageJ Traitement des données Wayne Rasband
Logiciel d’analyse image lab Traitement des données Bio-Rad
Logiciel d’analyse MxPro Traitement des données Agilent technologies
Logiciel 2100 Expert Traitement des données Agilent technologies
C. Matériels et Méthodes
77
Membrane Immobilon-PTM Western-blot (transfert) Millipore
Microscope confocal Microscopie Leica
Milieu de montage Microscopie Invitrogen
Milieu de montage Ultramount Microscopie Dako
pH-mètre Préparation de solutions Radiometer
Plaques de culture 6 puits Culture cellulaire Falcon
Puces ARN Vérification intégrité des ARN Agilent technologies
Thermocycleur PCR Eppendorf
Thermocycleur LightCycler® PCR temps réel Roche
Transblot Western-blot (transfert) Bio-Rad
Support puce ARN Puces à ARN Agilent technologies
Réactifs Fournisseurs
Acétone Prolabo
Acide acétique Prolabo
Acide chlorhydrique Prolabo
Acrylamide Euromedex
Agarose Euromedex
Anticorps bloquant anti-TGF- Fisher
APS (persulfate d’ammonium) Euromedex
BET (bromure d’ethidium) Euromedex
Béta-mercaptoéthanol Sigma-Aldrich
Biorad Protein Assay Kit Bio-Rad
Bleu de Coomassie G250 et R250 Sigma-Aldrich
Bleu trypan Sigma-Aldrich
Blotto Bio-Rad
Colorant Violet cristal Sigma-Aldrich
CTGF ( connective tissue growth factor) Sigma-Aldrich
DEPC (diéthyl pyrocarbonate) Sigma-Aldrich
DTT (dithiothréitol) Merck
DMSO (diméthylsulfoxyde) Sigma-Aldrich
C. Matériels et Méthodes
78
EDTA (Acide éthylène diamino-tétraacétique) Sigma-Aldrich
Ethanol Prolabo
Glycérol Sigma-Aldrich
Glycine Euromedex
Glutaraldéhyde Sigma-Aldrich
HEPES Merck
IL-1interleukine Sigma-Aldrich
Isopropanol Prolabo
Kit ECL prime Amersham
Kit de détection de la sénescence Sigma-Aldrich
Kit ELISA anti-collagène IV Euromedex
Kit ELISA anti-TGF- Promega
Réactifs Fournisseurs
Kit LSAB+ System-HRP Dako
Méthanol Prolabo
Maxima first strand DNA synthesis Thermo scientific
Maxima sybr green/ROX qPCR Master Mix Thermo scientific
MgCl2 Merck
NaCl Euromedex
NaOH Prolabo
Na3VO4(orthovanadate de sodium) Sigma-Aldrich
Milieu de culture : DMEM 1g/L de glucose Invitrogen
Milieu de culture : HBSS Invitrogen
Milieu d’enrobage pour coupes congelées NEG 50 Thermo Scientific
Penicilline/streptomycine Invitrogen
Pepsine Invitrogen
Peroxyde d’hydrogène Sigma-Aldrich
SAB (sérum albumine bovine) Euromedex
SDS (Sodium Dodécyl sulfate) Euromedex
SVF (sérum de veau fœtal) Invitrogen
Standard de masse moléculaire de protéines Fermantas
SYBR® Premix Ex Taq™ Takara Bio Inc
C. Matériels et Méthodes
79
Tampon de lyse RIPA (radioimmunoprecipitation assay) Sigma-Aldrich
TEMED (tétraméthyl-éthylène-diamine) Sigma-Aldrich
TGF-1 (transforming growth factor- 1) Sigma-Aldrich
TGF-signaling phospho-specific antibody array Euromedex
Tri-reagent Euromedex
Tris (tris-(hydroxyméthyl))-aminométhane Euromedex
Trypsine-EDTA Invitrogen
Tween-20 Sigma-Aldrich
Gène à
amplifier
Amorce sens (5’3’) Amorce antisens (5’3’)
1(IV)
humaine
TAGAGAGGAGCGAGATGTTC GTGACATTAGCTGAGTCAG
G
2(IV)
humaine
GGGTTACCCTGGCTTGAGTG AGGCCCTTGATAGCCATCC
5(IV)
humaine
TAAAAGAGCCCACGGTCAAG AATGAATGGCTGGATGCTCT
6(IV)
humaine
GGCACAAAGGATTTCTTGGA GATTTGCCCTTGATGCCATA
1(IV) murine GGTGAAAGGGGAGAAAAAGG ACCTGTCAAACCTGGCTGTC
2(IV) murine CTTACTGGGGACTTTGGTGA CGTTATCCCAGGAAATCCAA
5(IV) murine CCAAAAGGTGATCGTGGTTT TCCCTGAAGACCAATTCCTG
6(IV) murine GCTGCCTGGACTAGATGGAA TAAGCCTGGTGGTCCTATGG
GAPDH
humaine
ACGGATTTGGTCGTATTGGG TGATTTTGGAGGGATCTCGC
RPS29 murin AAGATGGGTCAACCAGCTCTAC
TG
AGACGCGGCAAGAGCGGGA
A
MMP-1
humaine
TGGCATTCAGTCCCTCTATGG AGGACAAAGCAGGATCACA
GTT
Fibronectine
humaine
ACCTACGGATGACTCGTGCTTTG
A
CAAAGCCTAAGCACTGGCA
CAACA
Apoprotéine j GGATGAAGGACCAGTGTGACAA CAGCGACCTGGAGGGATT
C. Matériels et Méthodes
80
humaine G
Ostéonectine
humaine
GAGACCTGTGACCTGGACAATG GGAAGGAGTGGATTTAGAT
CACAAGA
SM22 humaine CGTGGAGATCCCAACTGGTT AAGGCCAATGACATGCTTTC
C
p21WAF-1
humaine
CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA CCAGGACTGCAGGCTTCCT
p53 humaine AAGAAACCACTGGATGGAGAA CAGCTCTCGGAACATCTCGA
A
TGF-1
humain
GCGTGCTAATGGTGGAAAC CGGTGACATCAAAAGATAA
CCAC
TGF-RII
humain
GTCTACTCCATGGCTCTGGT ATCTGGATGCCCTGGTGGTT
Anticorps primaire Spécificité Origine Dilution
COL4A (COL-94) :
sc-59814 (Santa Cruz)
Collagène de type IV
humain non dénaturé
Souris 1/100
Rabbit anti humain
collagen type IV :
MD-22-0011
(RayBiotech)
Collagène de type IV
humain
lapin 1/5000
COL4A1/3 (G-20) :
sc-9301 (Santa Cruz)
Chaînes 1 et 3 du
collagène de type IV
humain et murin
Chèvre 1/200
COL4A2 (C-17) : sc-
70243 (Santa Cruz)
Chaîne 1 du collagène de
type IV humain
Lapin 1/200
Collagène IV clone
CIV22 (DAKO)
Collagène de type IV
humain de mammifères
Souris 1/200 ou 1/50
(immunocytochimie ;
Immunohistochimie)
Anticorps bloquant
anti-TGF-1 (TB21)
(thermo scientific)
TGF-1 humain Souris 10 µg/mL
C. Matériels et Méthodes
81
Anticorps secondaire couplé à la peroxydase Spécificité dilution
Anticorps de souris (SIGMA) Anti-IgG de chèvre 1/10000
Anticorps de singe (GE healthcare) Anti-IgG de lapin 1/10000
Anticorps de mouton (GE Healthcare) Anti-IgG de souris 1/10000
Alexa fluor 488 (DAKO) Anti-IgG de souris 1/200
C. Matériels et Méthodes
82
II. Méthodes
II-1 Isolement et culture cellulaire
Les cellules étudiées sont des fibroblastes dermiques extraits de prépuces ou de
fragments de seins « sains ». Ces biopsies, sont obtenues auprès du service de Chirurgie
pédiatrique de l’American Memorial Hospital (Reims) (prélèvements de prépuces pour les
patients de 1 à 10 ans) et du laboratoire d’anatomie et de cytologie pathologiques de l’Institut
Jean Godinot (Reims) (prélèvements de fragments de seins pour les patients de 37 à 89 ans)
respectivement.
Les fragments de peau sont tout d’abord dégraissés avant d’être coupés en très petits
morceaux placés dans un flacon de culture ventilé de 25 cm2 où nous les laissons sécher
quelques minutes afin de faciliter l’adhésion au support de culture avant de rajouter du
milieux DMEM supplémenté de 10% (v/v) de sérum de veau fœtal et de 1% de pénicilline
10000 U/mL streptomycine 100 µg/mL. Le milieu est changé deux fois par semaine. Les
fibroblastes migrent à partir des explants et se multiplient jusqu’à confluence. Ils sont incubés
à 37°C en atmosphère contrôlée contenant 5% de CO2 et détachés à confluence avec une
solution de PBS contenant 0,25% de trypsine, et utilisés avant le 5ème passage.
II-2 Immunohistochimie
Les fragments de peau collectés sont rincés à la PBS puis dégraissés avant d’être coupés
en morceaux d’environ 5 mm de diamètre et congelés à -80°C.
II-2-1 Coupes congelées
Les fragments de peau sont déposés dans du milieu d’enrobage pour coupes congelées
et nous réalisons alors des coupes de 5 µm d’épaisseur, à l’aide d’un cryostat, que nous
déposons sur lames SuperFrost®. Ces lames sont ensuite lavées deux fois dans de l’eau
distillée pendant 5 minutes puis 2 fois 10 minutes dans la PBS avant d’être incubées avec
l’anticorps primaire anti-collagène IV (DAKO) dilué au 1/200ème pendant 45 minutes en
chambre humide à température ambiante. Elles sont ensuite rincées 10 minutes à la PBS sous
agitation puis incubées 10 minutes avec l’anticorps secondaire couplé à l’Alexa fluor 488
dilué au 1/200ème dans de la PBS avant d’être rincées 10 minutes avec de la PBS puis 10
C. Matériels et Méthodes
83
minutes avec de l’H2O distillée et les noyaux sont ensuite contre colorés avec du DAPI. Des
lames ont été préparées sans l’étape d’incubation avec l’anticorps primaire et d’autre sans
l’étape d’incubation avec l’anticorps secondaire comme témoins négatifs. La fluorescence est
observée au microscope confocal.
II-2-2 Coupes de peaux incluses en paraffine
Nous avons travaillé à partir de coupes de peau incluses en paraffine fournies par le Dr
Patricia ROUSSELLE et le Dr Odile DAMOUR de l’institut de biologie et de chimie des
protéines de Lyon. Pour ces marquages nous avons utilisé le kit LSAB+ System-HRP.
La première étape, le déparaffinage, consiste en 3 traitements de 5 minutes dans du
méthylcyclohexane, puis 2 fois 5 minutes dans l’alcool à 100° suivis de 5 minutes dans
l’alcool 95° et 5 minutes 70°. Les lames sont ensuite rincées d’abord 10 minutes à l’eau
distillée puis 10 minutes à la PBS. La seconde étape dite « de démasquage » consiste à traiter
les lames 30 minutes au bain marie bouillant avec du tampon citrate 0,007 mol, pH 7,3. Puis
après un rinçage de 5 minutes à la PBS les lames sont placées 10 minutes à 37°C dans de la
pespine 0,4% dans l’HCl 0,2N puis de nouveau rincées 5 minutes à la PBS. La troisième
étape consiste en l’inhibition des peroxydases endogènes par traitement avec une solution de
peroxyde d’hydrogène à 3% pendant 5 minutes avant de rincer à l’eau distillée.
L’étape suivante est le blocage des sites antigéniques non spécifiques en déposant sur les
lames une solution de PBS à 5% de BSA, 30 minutes à température ambiante, en chambre
humide. Les lames sont ensuite incubées avec l’anticorps primaire anti-collagène IV dilué au
1/50 pendant 1h en chambre humide à température ambiante. Après un rinçage de 10 min à la
PBS, une goutte de réactif de biotinylation (Dako) est déposée pendant 45 minutes à
température ambiante avant de rincer de nouveau 10 minutes à la PBS. Une goutte de réactif
streptavidine couplé à l’HRP (Dako) est ensuite ajoutée pendant 45 minutes à température
ambiante avant de rincer encore 10 minutes à la PBS. La révélation se fait ensuite par ajout
sur les lames d’une goutte constituée de 50% de tampon et 50% de chromogène pendant 30
secondes. Les lames sont ensuite rincées 2 fois 5 minutes à l’eau distillée. Les coupes sont
ensuite montées entre lame et lamelle avec du milieu de montage avant d’être analysées au
microscope.
C. Matériels et Méthodes
84
II-3 Spectroscopie Raman sur coupes transversales de peau
II-3-1 Principe
La spectrométrie Raman repose sur le principe de la diffusion inélastique de la lumière
par un milieu. En effet, lorsqu'on soumet un échantillon à une source excitatrice
monochromatique de type laser, la majeure partie des photons incidents n'interagit pas avec le
milieu et la lumière diffusée possède alors la même fréquence que la lumière incidente
(diffusion élastique). Quelques photons incidents échangent cependant de l'énergie avec le
milieu, ce qui engendre un changement de fréquence d'une partie de la lumière diffusée par
rapport à celle incidente (diffusion inélastique) (figure 27).
Figure 27 : Schéma de diffusion de la lumière Lorsque le faisceau lumineux monochromatique entre en interaction avec un échantillon, la majorité des photons est diffusée élastiquement (même fréquence, même longueur d’onde) que les photons incidents (diffusion de Rayleigh ou diffusion élastique). Une petite fraction de photon sont diffusés à des énergies différentes que les photons incidents (diffusion Raman ou diffusion
inélastique).
La mesure de l’intensité du rayonnement diffusé conduit à un spectre qui correspond à
l’empreinte structurale du composé étudié, sur lequel la fréquence des bandes est reliée aux
énergies de vibration des liaisons atomiques de la matière éclairée. Le spectre obtenu
représente l’intensité de la diffusion Raman (axe des ordonnées) en fonction de la différence
C. Matériels et Méthodes
85
de fréquence entre celle de la raie excitatrice et celles des raies de diffusion (axe des abscisses
exprimée en cm -1).
II-3-2 Analyse
Cette étude a été réalisée en collaboration avec le Dr Olivier PIOT et The Thuong
NGUYEN (Equipe « Biophotonique et Technologies pour la Santé », FRE CNRS/URCA
3481 MEDyC). Les données Raman ont été collectées avec un microspectromètre LabRAM
(Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d’Ascq, France), équipé d’un détecteur CCD, et utilisant une
diode laser de 660 nm comme source d’excitation. Un objectif x100 a permis de focaliser le
rayon laser incident et de collecter la dispersion Raman. La résolution spectrale est de 4 cm-1.
Des coupes de peau de 5 µm, issues de fragments de seins de 3 patients d’âges différents, sont
déposées sur fenêtres de CaF2 (Crystran Ltd., Dorset, UK) et analysées en mode image. Pour
une coupe, 6 zones de 50x50 µm2 autour de la JDE sont scannées point par point en utilisant
un pas de 0,5 µm.
II-4 Obtention des différents modèles de vieillissement
II-4-1 Modèle murin
II-4-1-1 Vieillissement naturel
Nous avons isolé des fibroblastes de souris jeunes (7 semaines) et de souris âgées (95
semaines)
II-4-1-2 Vieillissement accéléré
Le modèle de souris SAM est souvent utilisé pour étudier le vieillissement. Ces souris ont
été obtenues à partir de croisements consanguins de souris AKR/J permettant d’obtenir 5
lignées sources originales ARK présentant une sénescence accélérée et servant de lignées
progénitrices de la série P (SAMP, senescence prone) et de 3 lignées de souris ARK
présentant un vieillissement normal servant de lignées progénitrices de la série R (SAMR,
senescence resistant) (Takeda et al., 1981).Il existe plusieurs lignées différentes dont les
caractéristiques sont répertoriées. L’évaluation du degré de sénescence s’effectue en utilisant
un système de note qualifiant les différents signes cliniques et les lésions comme étant liés
au processus de vieillissement : souplesse de la peau, brillance et perte du poil, lésions du
C. Matériels et Méthodes
86
système oculaire, comportement au niveau du temps de réaction. Dans cette étude nous
avons utilisé des ARN de fibroblastes à P0 provenant de la peau du dos de souris SAMP et
d’une lignée de souris SAMR, obtenus auprès de l’UMR CNRS 5086 à l’IBCP (Lyon).
II-4-2 Modèle humain
II-4-2-1 Vieillissement naturel
Les fibroblastes dermiques issus de fragments de peaux de patients d’âges variables
sont utilisés avant le 5ème passage.
II-4-2-2 Vieillissement accéléré induit par passages successifs
Lorsque les fibroblastes atteignent l’état de confluence, ils sont trypsinés pour être
réensemencés : ils subissent un “passage”. Pour cela ils sont rincés avec de la PBS, détachés
avec trypsine (0,5%) puis réensemencés. Les fibroblastes dermiques et les milieux
conditionnés sont collectés à chaque passage et congelés à –80°C et -20°C respectivement.
II-4-2-3 Vieillissement accéléré induit par traitement au peroxyde
d’hydrogène
50000 cellules sont ensemencées par puits (1 plaque 6 puits par condition) dans du
milieu DMEM 1g/L de glucose supplémenté de 10% de SVF jusqu’à ce que les cellules
atteignent environ 70% de confluence. Nous traitons ensuite les cellules avec des doses allant
de 0 à 200 µM de peroxyde d’hydrogène. Après 1h30 de traitement, les cellules sont rincées 3
fois à la PBS puis du milieu neuf sans SVF est ajouté. Les cellules et les milieux conditionnés
sont collectés 48h plus tard.
II-4-2-4 Vieillissement accéléré induit par traitement au chlorure de
sodium
10000 cellules sont ensemencées par puits (1 plaque 6 puits par condition) dans du
milieu DMEM 1g/L de glucose supplémenté de 10% de SVF. Après 2h d’incubation,
correspondant à l’adhésion des cellules au support, le chlorure de sodium est ajouté pour
obtenir une concentration finale allant jusqu’à 300 mM (le milieu de culture seul en contenant
C. Matériels et Méthodes
87
150 mM). Au bout de 7 jours, les milieux sont changés, puis le 12ème jour, ils sont remplacés
par du milieu sans SVF pendant 48h avant de collecter les cellules et les milieux conditionnés.
II-5 Mesure de la viabilité cellulaire
Le bleu trypan est un colorant de haute masse moléculaire utilisé pour étudier la
viabilité des cellules. Il s’infiltre au travers des membranes plasmiques endommagées des
cellules mortes, les faisant apparaître en bleu alors que les cellules viables ne sont pas
perméables à ce colorant). Après détachement des cellules et centrifugation, le culot cellulaire
est repris dans 100 µL de milieu. 10 µL de cette suspension sont mélangés avec 10 µL de bleu
trypan, puis 10 µL sont prélevés et déposés sur une cellule de comptage pour la mesure, à
l’aide d’un compteur automatique (Countess, Life Technologies), des cellules bleues et des
cellules non colorées.
II-6 Mesure de l’activité de la Senescence Associated--galactosidase
Cette étude a été réalisée avec un kit de détection (Senescence Cells Histochemical
Staining Kit, Sigma-Aldrich) basé sur une coloration histochimique traduisant l’activité de la
-galactosidase à pH 6. Dans ces conditions, l’activité -galactosidase est facilement
détectable dans les cellules sénescentes, mais indétectables dans les cellules quiescentes,
immortelles ou tumorales.
Les cellules sont d’abord rincées 2 fois avec 1 mL de PBS par puits, puis elles sont fixées
avec une solution de fixation préalablement diluée 10 fois pendant 6 à 7 minutes.
Les cellules sont de nouveau rincées 3 fois avec de la PBS puis 1 mL de la solution de
réaction est ajoutée dans chaque puits. Cette solution contient 10% de solution de coloration
10X, 1,25% de réactif B, 1,25% de réactif C, 85% d’eau distillée et 2,5% de solution X-Gal
préalablement chauffée une heure à 37°C. Les cellules sont ensuite incubées toute la nuit à
37°C dans une atmosphère dépourvue de CO2 puis les cellules colorées et non colorées sont
comptées au microscope.
II-7 Analyse en PCR quantitative
II-7-1 Extraction d’ARN
C. Matériels et Méthodes
88
Les ARN totaux ont été extraits en utilisant le réactif d’extraction Tri Reagent™. Les
cellules sont rincées trois fois par de la PBS puis lysées en présence de 1 mL de réactif
permettant la dénaturation des acides nucléiques, la dissociation des protéines qui leur sont
associées, et possèdant également une activité inhibitrice sur les ribonucléases endogènes. La
couche cellulaire est grattée puis le lysat est transféré dans un tube et incubé à température
ambiante avant d’y ajouter 200 µL de chloroforme. Les tubes sont agités énergiquement,
incubés durant 10 minutes à température ambiante puis centrifugés (12000 g – 10 min - 4°C).
Le chloroforme permet la séparation des acides nucléiques par solubilisation différentielle. La
phase aqueuse, contenant les ARN, est prélevée et précipitée par 500 µL d’isopropanol,
pendant 2 heures à -20°C, avant d’être centrifugée (12000 g - 10 min - 4°C). Après
élimination du surnageant, le culot d’ARN est lavé avec 1 mL d’éthanol 75 % (v/v), séché à
l’air et dissous dans 20 µL d’eau distillée préalablement traitée au DEPC.
II-7-2 Analyse qualitative et quantitative des ARN
Cette étape a été réalisée à l’aide d’une puce ARN et du bioanalyser agilent. Cette
technique utilise la technologie « lab-on-a-chip » (laboratoire sur puce). La puce en question
est composée de plusieurs puits, dont 12 destinés aux échantillons, et 1 au marqueur de taille.
Au niveau de ces puits, il existe des microréseaux.
9 µL d’un gel filtré (mélangé à un intercalant de l’ARN spécifique et fluorescent) sont
déposés dans 2 puits spécifiques de la puce (notés G). Le gel est réparti équitablement au
niveau de chaque puits, et remplit les microréseaux. 5 µL de tampon sont alors ajoutés dans
chaque puits, avant de déposer ensuite 1 µL d’échantillon préalablement dénaturé 2 minutes à
70°C et le marqueur de taille. La puce est vortexée 1 minute afin d’homogénéiser le tampon et
les échantillons, puis placée dans l’appareil. Le programme est lancé. Les puits sont analysés
un par un, en commençant par le marqueur de taille, qui sert d’étalon aux niveaux qualitatif et
quantitatif. Une électrode est en contact avec chaque puits. Au moment de l’analyse, cette
électrode est soumise à un haut voltage, qui va permettre une séparation très rapide des brins
d’ARN de l’échantillon en fonction de leur taille (passage à travers le gel, au sein des
microréseaux plus ou moins rapide). Au moment de leur passage dans le gel, les molécules
d’ARN vont se lier spécifiquement au colorant (cyanines). En fin de course (fin de
colonne, fin du microréseau), les molécules sont détectées par fluorescence (figure 28).
Les molécules sont excitées par 2 lasers, et les ARNs (liés à aux cyanines 3 et 5) vont émettre
un rayonnement fluorescent.
C. Matériels et Méthodes
89
Figure 28: Profil des ARN analysées sur puces Agilent
Les résultats du contrôle de l’ARN sont obtenus sous forme de bandes de type gel et de pics d’électrophorèse. Un facteur d’intégrité ou RIN (RNA Integrity Number) est attribué à chaque échantillon d’ARN total, ce qui permet la normalisation des analyses.
II-7-3 Transcription inverse
Cette étape est réalisée à l’aide du kit « First Strand cDNA Synthesis » (Thermo
Scientific). 2 µg d’ARN sont préparés dans un volume total de 16 µL d’eau DEPC. Ces ARN
sont dénaturés 3 minutes à 90°C avant d’y ajouter 4 µL de mélange réactionnel 5X (contenant
le tampon de réaction, les dNTPs, les oligo(dT)s et les random hexamer) et 2 µL du mélange
enzymatique MAXIMA (contenant la reverse transcriptase et un inhibiteur des RNAse afin de
protéger les ARN de la dégradation). La réaction de polymérisation s’effectue à 42°C pendant
45 minutes.
II-7-4 PCR temps réel
II-7-4-1 Principe
La réaction d’amplification de la séquence d’ADN cible suit les mêmes étapes que la
PCR classique, c’est-à-dire dénaturation, hybridation, élongation. A la différence d’une PCR
classique, la PCR temps réel permet de quantifier et de caractériser l’amplicon formé en
temps réel. Cela permet une quantification relative du gène d’intérêt par rapport à un gène de
référence non régulé.
Le principe de la technique est la détection du nombre d’amplicons obtenus en fin
d’élongation de chaque cycle de PCR en mesurant l’augmentation de l’intensité de
fluorescence induite par l’incorporation du SYBR-Green dans l'ADN sous forme double brin.
C. Matériels et Méthodes
90
En effet, ce composé n’est fluorescent que lorsqu’il est lié à de l’ADN double brin
tandis que sous sa forme libre, cette cyanine asymétrique de formule C32H37N4S, n’émet pas
de fluorescence.
II-7-4-2 Mise au point
Les couples d’amorces ont été dessinés et sélectionnés selon plusieurs critères : la
taille du fragment amplifié (inférieure à 250 pb) ainsi que l'absence de formation d'homo ou
d'hétérodimères d’amorces et de boucles intramoléculaires (vérifiée grâce au logiciel
OligoV2). La spécificité des amorces vis-à-vis de la séquence de l’ADN complémentaire cible
est également vérifiée à l’aide du logiciel BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) qui
permet de tester l’alignement des amorces avec l’ensemble des séquences répertoriées chez
l’Homme. La qPCR est réalisée sur un mélange de cDNA dilués au 1/10ème, 1/100ème,
1/1000ème, 1/10000ème et 1/100000ème afin de déterminer l’efficacité de PCR pour chaque
couples d’amorces. Pour chaque gène, le couple d’amorce présentant la meilleure efficacité
d’amplification (proche de 100%) et un seul produit d’amplification (vérifié avec la courbe de
fusion) a été retenu pour la suite de l’étude.
II-7-4-3 Protocole
5 µL d'ADNc dilués au 1/50ème sont additionnés de 12,5 µL du mélange SYBR
GREEN (contenant la Taq polymérase et l’agent intercalant) ainsi que de 0,5 µL de composé
fluorescent de référence (ROX), 0,5 µL d'amorces sens et anti-sens [0,2µM] et 6 µL d'H2O.
Les milieux réactionnels sont déposés sur une plaque 96 puits puis placés dans
l'appareil PCR en temps réel Mx3005P où l'amplification se réalise selon le programme
suivant : 10 s à 95°C puis (5s à 95°C ; 30s à 60°C ; 15s à 72°C) pendant 50 cycles et enfin 1
min à 95°C ; 30 s à 65°C ainsi que 30 s à 95°C.
Les valeurs des Ct obtenues (correspondant à un niveau seuil où la fluorescence détectée est
supérieure au bruit de fond) sont normalisées grâce aux gènes de ménage tels que la GAPDH,
RPS-29 et la -actine. La spécificité de la réaction est vérifiée par analyse de courbes de
fusion. L’analyse de l’expression relative des gènes est réalisée selon la méthode du delta-
delta Ct.
C. Matériels et Méthodes
91
II-8 Analyse protéique
II-8-1 Obtention des protéines à partir des milieux conditionnés
Afin d'étudier l’expression des protéines sécrétées, les surnageants de culture sont
collectés, centrifugés à 1200 g afin d’éliminer les débris cellulaires. Ils sont ensuite placés sur
des microconcentrateurs de type Vivaspin 6 PES 10 kDa, préalablement rincés à l’eau, dont la
membrane retient les protéines de masse moléculaire supérieure à 10 kDa. Ils sont centrifugés
à 3220 g pendant 1h30. Les protéines concentrées sont alors prêtes à être dosées.
II-8-2 Extraction des protéines à partir des couches cellulaires
La couche cellulaire, préalablement lavée à la PBS, est grattée avec 500 µL de tampon
de lyse RIPA. L’extrait est alors collecté et placé dans des tubes à 4°C qui seront agités
vigoureusement toutes les 5 minutes pendant 30 minutes. Les échantillons sont ensuite
centrifugés 10 minutes à 10000 g afin de ne récupérer que le surnageant contenant les
protéines solubles qui sont alors prêtes à être dosées.
II-8-3 Dosage protéique
Nous utilisons une méthode fluorimétrique de détection des protéines. 10 µL
d’échantillon dilué au 1/100ème sont additionnés de 190 µL d’un mélange réactionnel composé
de 199 µL de solution tampon et de 1 µL de réactif du kit de dosage protéique Quant-itTM
Protein Assay. Les échantillons sont dosés à l’aide du fluorimètre QubitTM préalablement
calibré à l’aide de standards. La fluorescence est mesurée à la longueur d’onde d’excitation de
485 nm et d’émission de 590 nm.
II-8-4 Western-blot
II-8-4-1 Electrophorèse
50 µg d’extraits protéiques totaux préalablement dénaturés 3 minutes à 95°C et
additionnés de tampon de charge (Laemmli) migrent dans un gel Tris-Glycine dont le
pourcentage d’acrylamide varie selon la masse moléculaire de la protéine étudiée. En effet, le
pourcentage sera élevé pour séparer les protéines de faibles masses moléculaires alors qu’un
pourcentage faible sera utilisé pour séparer les protéines de plus grandes masses moléculaires.
C. Matériels et Méthodes
92
La migration se déroule pendant 1h30 heure à 100 volts dans une cuve contenant du tampon
de migration (Tris 25 mM pH 8.3, SDS 0.1% (m/v), glycine 192 mM).
II-8-4-2 Transfert
La membrane de PVDF doit être préalablement activée dans du méthanol pendant 30 s
puis équilibrée 15 min dans le tampon de transfert (Tris 48 mM pH 8,2, glycine 39 mM,
méthanol 20% (v/v)). Les protéines du gel sont alors transférées sur la membrane dans une
cuve contenant du tampon de transfert à l’aide d’un appareil de transfert durant 1h30 à 4°C à
80V ou 45 minutes à 100V selon le la masse moléculaire de la protéine étudiée.
II-8-4-3 Immunodétection
Les membranes sont ensuite saturées à l’aide de TBS-T (Tris HCl 20 mM pH 7.5,
NaCl 150 mM et 0.1% de Tween 20) contenant 5% de blotto durant 2 heures à température
ambiante. Elles sont ensuite incubées avec l’anticorps primaire dilué dans du TBS-T
contenant 1% de blotto, toute la nuit à 4°C. Après 1 lavage au TBS-T de 10 min, puis 3
lavages de TBS-T de 5 min la membrane est incubée avec l’anticorps secondaire dilué au
1/10000ème dans du TBS-T contenant 1% de blotto, durant 1h à température ambiante. La
membrane est lavée 2 fois 10 min au TBS-T puis 2 fois 10 min au TBS 1X simple afin
d’éliminer le Tween 20. La révélation est effectuée à l’aide du Kit de chimiluminescence ECL
et de l’appareil ChemiDoc.
II-8-5 Dosage E.L.I.S.A (enzyme-linked immunosorbant assay)
II-8-5-1 Collagène IV
Cette étude a été réalisée avec le kit ELISA pour le collagène IV de chez UscnK (test
ELISA sandwich). Nous avons déposé 100 µL de milieux conditionnés préalablement dilués
au 1/10ème sur une plaque pré-tapissée en anticorps anti-collagène IV. Une gamme étalon (0 à
4000 pg/mL) est réalisée en parallèle. La plaque est ensuite mise à incuber pendant 2h à 37°C.
Le contenu des puits est ensuite éliminé et 100 µL de réactif de détection A sont ajoutés dans
tous les puits avant de remettre la plaque à incuber 1h à 37°C (ce réactif contient des anticorps
spécifiques du collagène IV couplé à de la biotine). Les puits sont de nouveaux vidés et rincés
3 fois avec la solution de lavage contenue dans le kit. 100 µL du réactif de détection B sont
C. Matériels et Méthodes
93
alors ajoutés (ils contiennent de l’avidine couplé à l’HRP) et la plaque est remise à incuber 30
minutes à 37°C avant d’être de nouveau lavée 5 fois avec la solution de lavage. 90 µL de
substrat TMB sont ajoutés et la plaque est mise à incuber 15 à 25 minutes à 37°C (selon
l’intensité de coloration ; plus il y a de HRP fixé, plus le substrat va réagir et va se colorer en
bleu) puis la réaction est stoppée par ajout de 50 µL de solution stop contenant de l’acide
sulfurique 1N. L’absorbance est ensuite lue directement à l’aide d’un spectrophotomètre à 450
nm.
II-8-5-2 TGF-1
Ce dosage a été réalisé avec le kit TGF1 EMAX ImmunoAssay Systems (Promega).
Une plaque 96 puits est d’abord tapissée avec 100 µL d’anticorps monoclonal anti-TGF-1
(1µg/mL) dilué au 1/1000ème dans du tampon carbonate et laissée incubée toute la nuit. 270
µL de solution de blocage sont ajoutés dans chaque puits afin de bloquer tous les sites de
fixation non spécifiques. Les milieux conditionnés à tester, dilués au 1/10ème, sont ajoutés
dans les puits ainsi que les échantillons de la gamme standard préalablement préparés par
dilution en cascade d’un tube standard fourni (gamme allant de 32 à 1000 pg/mL). La plaque
est ensuite incubée 1h30 sous agitation et à température ambiante. Les puits sont ensuite vidés
et rincés 3 fois avec la solution de lavage. 100 µL/puits d’anticorps secondaire polyclonal
anti-TGF-1 dilué au 1/1000ème dans le tampon 1X sont ensuite ajoutés et laissés à incuber 2h
à température ambiante sous agitation. Les puits sont de nouveau vidés et rincés 5 fois avec le
tampon 1X 100 µL d’HRP conjugué dilué au 1/100ème dans le tampon 1X sont ajoutés et la
plaque est de nouveau incubée 2h. Comme précédemment les puits sont rincés 5X. Dans la
dernière étape 100 µL/puits de TMB sont ajoutés et la plaque est incubée à température
ambiante pendant environ 15 minutes avant de stopper la réaction par ajout de 100µL d’acide
chlorhydrique 1N. L’absorbance est mesurée à 450 nm au spectophotomètre (figure 29).
C. Matériels et Méthodes
94
Figure 29: Principe du dosage ELISA anti TGF-1
Le TGFβ1 Emax ® ImmunoAssay System est une méthode de détection sensible et spécifique de la forme active du TGFβ1. Les plaques sont tapissées d’anticorps monoclonaux anti- TGFβ1 qui fixent le TGFβ1 soluble. Le TGFβ1 capturé est reconnu par un second anticorps polyclonal spécifique. Le taux d’anticorps spécifiquement fixés est détecté par un second anticorps spécifique de l’anticorps polyclonal couplé à la peroxydase de raifort qui réagira avec le substrat chromogénique induisant un changement de couleur qui sera mesuré au spectrophotomètre.
II-8-6 Etude des protéines phosphorylées : voie du TGF-1
Cette étude a été réalisée avec le kit « TGF-Beta Signaling Phospho-Specific antibody
Microarray» de chez Full Moon BioSystem. Les cellules sont lavées avec la PBS à 4°C puis
collectées par grattage, centrifugées à 4°C puis le culot est lavé avec la PBS 1X. Le
surnageant est éliminé et le culot additionné de billes de lyse et de 100 µL de tampon de lyse
dans lequel nous avons ajouté du NaVO3 (1mM final), du NaF (1mM final) pour inhiber les
phosphatases et des inhibiteurs de protéases (PICK dilué au 1/100ème). Les tubes sont agités
vigoureusement pendant 30 secondes, toutes les 10 minutes, pendant environ 1h sur glace
puis centrifugés 15 min à 14000 rpm à 4°C. Pour purifier l’extrait protéique et remplacer le
tampon de lyse par le tampon de biotinylation, le surnageant est alors placé dans sur colonne
contenant le tampon de marquage et centrifugé à 750 g pendant 2 minutes. Nous vérifions
alors la pureté des protéines en observant deux pics caractéristiques à 230 et 270 nm lors de
l’absorption UV des échantillons au spectrophotomètre. Nous passons ensuite à la
biotinylation des protéines ; pour cela, les protéines sont diluées à 10 µg/mL dans un volume
Tapissage des puits avec un anticorps
monoclonal anti-TGF beta 1
Blocage des sites aspécifiques
Incubation avec le milieu conditionné
Ajout de l'anticorps polyclonal anti-TGF-beta 1
Ajout de l'anticorps secondaire
couplé à HRP
Ajout du TMB suivi de la solution STOP.
C. Matériels et Méthodes
95
total de 75 µL de tampon de marquage et 3 µL de réactif (contenant 100 µL de DMF et 1 mg
de réactif biotine) sont ajoutés. Le mélange est incubé 1 à 2h à température ambiante sous
agitation puis 30 µL de solution stop sont ajoutés et le mélange est à nouveau incubé 30
minutes. Les lames présentant 176 anticorps différents sont incubées en présence de solution
de blocage, afin de bloquer les sites de fixation non spécifiques, pendant 45 minutes sous une
agitation de 55 rpm. Les lames sont ensuite rincées 10 fois avec de l’eau milliQ.
78 µL de lysat sont ensuite ajoutés à 6 mL de la solution de couplage et le mélange est déposé
sur les lames dans une chambre de couplage, elle-même agitées à 35 rpm pendant 1 h. Les
lames sont rincées 3 fois 10 minutes avec la solution de rinçage sous agitation à 55 rpm puis
10 fois à l’eau milliQ. La Cy3-streptavidine diluée au 1/1000ème dans la solution de détection
est ajoutée sur les lames qui sont incubées 20 minutes à l’abri de la lumière à 55 rpm avant de
les rincer 3 fois 10 minutes avec la solution de rinçage, sous agitation à 55 rpm, puis 10 fois à
l’eau millQ. Les puces sont alors prêtes à être analysées à l’aide du Chemidoc (figure 30).
Figure 30: Principe de l’antibody array
Les protéines sont extraites puis biotinylées, mises en contact des 176 anticorps et détectées par Cy3-streptavidine.
II-8-7 Immunoprécipitation des Smads phosphorylées
Afin d’analyser l’activation des Smads phosphorylées dans le modèle de vieillissement
avec H2O2, nous avons traités nos fibroblastes comme cités précédemment mais nous les
avons collectés à différents temps après l’incubation avec H2O2, et non plus seulement après
48h. Les extraits cellulaires sont collectés comme expliqué ci-dessus puis les lysats cellulaires
sont pré-purifiés par addition de 50 µL de billes de protéine G-agarose par mL de lysat et
incubés 10 minutes à 4°C sur agitateur orbitale. Cette étape permet d’éliminer les protéines
s’adsorbant à l’agarose. Les lysats sont ensuite centrifugés à 14000 g à 4°C pendant 10
minutes afin d’éliminer les billes et le surnageant est transféré dans un tube propre. Les
protéines sont dosées afin d’avoir une concentration d’1 µg/µL de protéines totales dans de la
C. Matériels et Méthodes
96
PBS afin de réduire la concentration de détergents dans le tampon. Nous ajoutons les
anticorps dilués au 100ème (Smad 2 ou Smad 3) à 500 µL de lysat cellulaire et nous laissons
agiter sur une roue pendant 2h à 4°C avant d’ajouter 50 µL de protéine A-G-agarose et de
remettre à agiter sur roue 1h. Les billes sont ensuite centrifugées 5 secondes à 14000 rpm ; le
surnageant est alors jeté et les billes sont rincées 3 fois avec 800 µL de PBS ; elles sont
ensuite re-suspendues dans 30 µL de tampon de charge, agitées vigoureusement, centrifugées
et le surnageant est déposé sur gel d’acrylamide afin de réaliser le western-blot. L’anticorps
utilisé pour l’immunorévélation est celui de la protéine phosphorylée (P-Smad 2/P-Smad 3).
II-9 Analyses statistiques
Toutes les expériences ont été réalisées en triplicata et les résultats sont présentés sous
la forme moyenne ± écart-type. Le test paramétrique de Student avec séries appariées
(méthode des couples) a été utilisé pour l’analyse statistique.
Les données sont considérées statistiquement significatives pour un p<0,05.
Les niveaux de probabilité sont schématisés de la manière suivante :
N.S = non significatif
* = p < 0,05
** = p < 0,01
*** = p < 0,001
97
D. Résultats
D. Résultats
98
I.Etude de ll ’expressiion du coll llagène IV llors
du viieii ll ll iissement naturell
I-1 Analyses à partir de peaux totales
I-1-1 Analyse par western-blot sur peaux totales
Nous avons extrait les protéines à partir de prépuces et de seins de patients d’âges
variables et avons réalisé un western-blot pour mettre en évidence la diminution de
collagène IV. Nous avons pour cela utilisé un anticorps (RayBiotech) dirigé contre le
collagène IV ([1(IV)2 ; 2(IV)]). La quantification de chaque western-blot se fait en
rapportant l’intensité de la bande d’intérêt sur l’intensité des protéines totales de
l’échantillon.
Le western-blot met en évidence une bande de masse moléculaire de 250 kDa
correspondant au collagène IV.
Nous avons analysé des prépuces d’1, 2, 4 et 5 ans. L’expression est plus élevée à 1 an
puis diminue de 50% à 2 ans puis elle n’est plus réellement modifiée (figure 31).
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
1 2 4 5
q u
a n
ti fi
ca ti
o n
d e
l'e
xp re
si o
n d
u c
o lla
g è
n e
IV
n a
ti f (
u n
it és
a rb
it ra
ir e
s)
âge ( ans)
Figure 31: Etude, par western-blot, de l’expression du collagène IV natif à partir de prépuces
Les protéines sont extraites à partir de fragments de prépuces avec un tampon de lyse RIPA. L’expression protéique du collagène IV a été analysée par la technique de western-blot (50 µg de protéines totales ont été déposés sur un gel contenant 7.5% d’acrylamide). Etude réalisée sur 4 patients âgés de 1, 2, 4 et 5 ans.
250 kDa
âge (ans)
1 2 4 5 1 4 5 âge (ans)
D. Résultats
99
La même étude a été réalisée à partir des fragments de peaux issus de seins de 35,
45, 54, 64 et 80 ans. Le résultat montre une bande de même masse moléculaire que pour
les prépuces (250 kDa) dont l’intensité diminue en fonction de l’âge (jusqu’à atteindre
72% de diminution entre 35 et 80 ans) (figure 32).
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
35 45 54 64 80
q u
an ti
fi ca
ti o
n d
e
l'e xp
re ss
io n
d u
c o
lla gè
n e
IV
( u
n it
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ar b
it ra
ir e
s)
âge (ans)
Figure 32: Etude, par western-blot, de l’expression du collagène IV natif à partir de fragments de peau de seins
Les protéines sont extraites à partir de fragments de seins avec un tampon de lyse RIPA. L’expression protéique du collagène IV a été analysée par la technique de western-blot (50 µg de protéines totales ont été déposés). Etude réalisée sur 5 patients âgés de 35, 45, 54, 64 et 80 ans.
I-1-2 Analyse immunohistochimique
I-1-2-1 Marquage fluorescent
I-1-2-1-1 Validation des coupes à étudier par mesure de la longueur de la JDE
La JDE s’aplanit au cours du vieillissement (disparition progressive des
invaginations). Afin d’éliminer les peaux présentant des caractères atypiques, nous
avons mesuré la longueur de la JDE sur les 38 coupes dont nous disposions.
Avec l’aide du Dr Christine Terryn, nous avons mis au point un programme sous Image
J permettant de mesurer la longueur de la JDE sur chaque coupe, avec le même
grossissement (figure 33).
250 kDa
35 45 54 64 80
âge (ans)
250 kDa
D. Résultats
100
Figure 33: Détermination du degré d’invaginations de la JDE sur coupes transversales de
peaux humaines Les coupes de peaux sont soumises à des analyses immunohistochimiques à l’aide d’un anticorps anti-collagène IV. Le degré d’invagination est ensuite mesuré sur Image J.
Toutes les coupes dont les valeurs sont éloignées de plus de 2 écart-types de leur
groupe sont considérées comme non représentatives et sont écartées de l’étude. Nous
avons regroupé les coupes par tranche d’âges : de 1 à 10 ans (n=14), de 31 à 40 ans
(n=2), de 41 à 50 ans (n=2), de 51 à 60 ans (n=7), de 61 à 70 ans (n=5), de 71 à 80 ans
(n=3) et de 81 à 90 ans (n=3). La figure 39 représente le degré d’invagination en
fonction de l’âge, une diminution proportionnelle est observée. Seules 2 coupes
aberrantes ont étés éliminées de l’étude (figure 34).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
01--10 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-89
ra ti
o a
/b
âge des patients (ans)
Figure 34 : Etude de l’invagination de la JDE au cours du vieillissement à partir des coupes
marquées avec un anticorps anti-collagène IV Degré d’invagination de la zone A-B : (longueur du polygone-distance A.B) / longueur du polygone. Les coupes ont été regroupées en 7 tranches d’âge : de 1 à 10 ans (n=14), de 31 à 40 ans (n=2), de 41 à 50 ans (n=2), de 51 à 60 ans (n=7), de 61 à 70 ans (n=5), de 71 à 80 ans (n=3) et de 81 à 90 ans (n=3).
D. Résultats
101
I-1-2-1-2 Analyse du réseau de collagène IV au cours du vieillissement
Le but de l’étude est de mettre en évidence une éventuelle discontinuité du
collagène IV au niveau de la JDE. Pour cela, des coupes transversales de peaux issues
de prépuces et de seins ont été marquées avec un anticorps anti-collagène IV (DAKO)
puis un anticorps secondaire couplé à un Alexa-fluor. Le collagène de type IV est bien
retrouvé au niveau de la jonction dermo-épidermique ainsi qu’au niveau des vaisseaux
sanguins dans le derme (figure 35).
Figure 35: Visualisation, en microscopie confocale, de la distribution du collagène IV sur coupes transversales de peau au cours du vieillissement (x20).
Les coupes de peau sont incubées avec un anticorps anti-collagène IV puis avec un anticorps secondaire couplé à l’Alexa fluor® 488. Elles sont observées à l’aide d’un microscope confocal (grossissement x20 et photographiées. Le marquage du collagène IV est représenté en vert, l’autofluorescence en rouge et les ondes de secondes harmoniques en violet.
Sur les 34 coupes éligibles, nous avons mis au point un programme sous image J
qui permet de quantifier les discontinuités éventuelles du réseau de collagène IV au
cours du vieillissement. Pour cela, sur une zone donnée de la JDE, nous avons calculé le
nombre de pixels colorés sur le nombre de pixels totaux. Plus ce ratio diminue plus le
réseau est discontinu (figure 36).
1 an 4 ans 5 ans
55 ans 65 ans 89 ans
Collagène IV Auto fluorescence seconde harmonique
épiderme
derme
JDE
1 mm 1 mm 1 mm
1 mm 1 mm 1 mm
D. Résultats
102
Les variations interindividuelles sont nombreuses et n’ont pas permis de mettre en
évidence de modification de la continuité du réseau en collagène IV au cours du
vieillissement.
Toutes les coupes n’ayant pas été réalisées et analysées le même jour, nous n’avons pas
réalisé de mesure quantitative de l’expression de collagène IV par la technique
d’immunofluorescence.
Figure 36: Estimation de la continuité du réseau de collagène IV au cours du vieillissement. Un ratio du nombre de pixels colorés sur le nombre de pixels totaux au niveau d’une zone de la JDE à été réalis. Patients de 1 à 10 ans (n=12), de 31 à 40 ans (n=2), de 41 à 50 ans (n=2), de 51 à 60 ans (n=7), de 61 à 70 ans (n=5), de 71 à 80 ans (n=3) et de 81 à 90 ans (n=3).
I-1-2-2 Marquage révélé à la peroxydase
N’ayant pu quantifier l’intensité du marquage et la quantité de collagène IV au
cours du vieillissement à l’aide du marquage fluorescent, nous avons décidé de réaliser
un marquage à la DAB pour révéler le collagène de type IV. Pour cela nous avons
travaillé sur des coupes provenant d’échantillons de peau inclus en paraffine fournis par
le Dr Patricia Rousselle de l’IBCP de Lyon. Cependant, les variations interindividuelles
étant considérables, cette étude ne nous a pas permis de mettre en évidence de
différences significatives entre les coupes de peaux jeunes et âgées (figure 37).
D. Résultats
103
Figure 37: Visualisation, en microscopie optique, de l’expression du collagène IV sur coupes transversales de peau au cours du vieillissement (x20)
A : les coupes de peau ont été marquées avec un anticorps anti-collagène IV biotinylé, lui-même révélé à l’aide de la streptavidine-HRP induisant une coloration marron lors de la réaction avec le chromogène. B : L’intensité de fluorescence a été quantifiée à l’aide du logiciel Image J. Tranche d’âge 41-54 ans (n=6 patients) et tranche d’âge 63-88 ans (n=5 patients).
A
B
0.5 mm 0.5 mm
0.5 mm 0.5 mm
D. Résultats
104
I-1-3 Etude du collagène IV de la JDE par microscopie RAMAN
La microscopie RAMAN a pour avantage d’être non destructive pour les
échantillons testés. Des études préliminaires nous ont d’abord permis de mettre en
évidence les différences spectrales entre le collagène I et le collagène IV purifiés (figure
38). Afin de pouvoir comparer les résultats, les spectres ont été normalisés sur la bande
amide I. Elle est située à 1668 cm−1 et 1673 cm−1 pour les collagènes I et IV
respectivement. La bande Amide I correspond principalement aux vibrations
d’étirement des groupes carbonyl C=O des liaisons peptidiques de la séquence Gly-X-
Y. Le décalage en nombre d’onde de la bande amide I reflète des environnements, au
niveau des groupes carbonyl, différents entre les deux types de collagène; ce qui
pourrait provenir d’une différence de proportion d’acides aminés aux positions X et Y.
La différence du ratio des intensités intégrées I1271/I1246 met en évidence une
différence dans les proportions de résidus proline. Le pic à 875 cm−1 provient des
hydroxyprolines, les vibrations à 856 et 920 cm−1 sont attribuées aux prolines et la
bande à 938 cm−1 correspond à la vibration de l’étirement C-C du squelette formé par
les séquences Gly-X-Y. En prenant en compte la normalisation du spectre sur la bande
amide I, le contenu en résidus proline et hydroxyproline apparait plus élevé dans le
collagène IV que dans le collagène I. Les 2 vibrations spécifiques de la phénylalanine
(1004 and 1033 cm−1) sont plus intenses dans le collagène IV, ce qui pourrait traduire
une quantité plus importante de cet acide aminé dans la collagène IV ou bien des
différences conformationnelles de ces résidus entre les deux protéines. La vibration de
815 cm-1 correspond à l’étirement C-O-C qui peut être attribué aux liaisons croisées
glucosyl-galactosyl-hydroxylysinonorleucine entre les tropocollagènes. Ce pic est plus
intense au niveau du collagène I, ce qui montre un contenu plus important en liaisons
croisées dans ce collagène, ce qui est corrélé avec la structure fibrillaire du collagène I.
L’information spectrale associée aux ponts disulfures se situe dans la gamme 500-550
cm-1. En effet, les vibrations d’étirement S-S du collagène IV apparaissent à 510 et 540
cm-1 et ces signaux sont dus aux ponts disulfures des domaines 7S. Cela indique que
ces ponts peuvent se trouver dans différents types de conformation: très stable gauche-
gauche-gauche (510 cm-1) et moins stable trans-gauche-trans (540 cm-1). Ces pics sont
associés avec une vibration d’étirement C-S à 722 cm-1. Cette information
conformationnelle du domaine 7S peut être utilisée comme marqueur in situ de la
D. Résultats
105
stabilité du réseau de collagène IV. Au contraire, pour le collagène I, les vibrations S-S
à 510 et 540 cm-1 n’apparaissent pas clairement.
Figure 38: Spectres RAMAN des collagènes I et IV purifiés
Les collagènes I et IV purifiés ont été déposés sur lame de CaF2. L’acquisition des spectres a été réalisée selon le mode point par point. Le temps d’acquisition était de 30s/spectre et la zone spectrale de 500 à 1800 cm
-1 .
Alors que les différences spectrales entre les collagènes I et IV ont étés
déterminées à partir d’extraits purs, nous avons tenté de mettre en évidence une
signature spectrale du collagène IV au sein de coupes de peaux jeunes et âgées.
Au niveau de la JDE, la bande amide I est retrouvée à 1658 cm−1, traduisant une
structure prédominante en a-hélice. Au niveau de la région spectrale 800-980 cm−1, les
pics correspondant aux résidus hydroxyproline (876 cm−1) et proline (920 cm−1) sont
présents en plus forte intensité dans les spectres du derme et de la JDE que pour le
spectre de l’épiderme. Le signal à 815 cm-1, attribué aux vibrations élastiques des
liaisons croisées du collagène, est également visible dans le derme et la JDE mais pas au
niveau de l’épiderme (figure 39).
D. Résultats
106
Ces résultats montrent que les collagènes I et IV présentent des signatures Raman très
spécifiques. Sur la base de ces signatures, il est possible de distinguer les structures
cutanées. Il faut toutefois noter que le signal enregistré au niveau de la JDE ne
correspond pas exclusivement à cette structure du fait de la limite de résolution de la
microscopie Raman (environ 1 µm) en comparaison avec la taille de la JDE. Des
développements instrumentaux
basés sur l’optique en champ proche devraient prochainement permettre d’enregistrer un
signal spécifique de la JDE. Ce qui permettra aussi d’étudier in situ les altérations de la
JDE associées au vieillissement cutané.
Figure 39: Spectre moyen et déviation standard de l’épiderme, du derme et de la jonction
dermo-épidermique Les spectres ont étés recueillis à partir d’une coupe de peau issue du sein d’une patiente de 41 ans et déposée sur une lame de CaF2. L’épiderme, le derme et l’hypoderme ont été analysés par spectroscopie RAMAN selon un mode image. 6 zones de 50 x 50 cm2 de diamètre ont été scannées point par point avec un pas de 0,5 µM.
I-2 Analyse à partir de fibroblastes dermiques
Dans un premier temps, nous avons étudié les variations d’expression génique du
collagène IV par les fibroblastes dermiques issus de prépuces et de seins afin d’avoir un
D. Résultats
107
panel de patients d’âges très variables. Les fibroblastes dermiques étudiés ont été isolés
à partir de fragments de peau de patients regroupés en 5 tranches d’âges : 1 à 10 ans
(n=8); 11 à 20 ans (n=5); 41 à 50 ans (n=2); 51 à 60 ans (n=2); 61 à 70 ans (n=7).
L’expression des différentes chaînes (IV) a été mesurée par PCR en temps réel. Les
chaînes 3 et 4 (IV) ne sont pas exprimées par les fibroblastes dermiques en culture.
Les chaînes 1 et 2(IV) sont fortement exprimées de 1 à 10 ans, puis une diminution
importante survient (90 % de baisse d’expression entre 1-10 ans et 41-50 ans pour
1(IV) et 88 % pour 2(IV)) jusqu’ à une stabilisation observée à partir du groupe 41-
50 ans (figure 40).
Nous avons également étudié l’expression des chaînes 5 et 6(IV), mais
l’efficacité de la PCR étant inférieure à 90%, nous n’avons pas validé les résultats
obtenus. Ceci s’explique par le fait que ces deux chaînes sont très faiblement exprimées
dans la JDE.
Dans cette première expérience, nous avons comparé des fibroblastes provenant
de 2 tissus différents et les résultats peuvent être remis en question. C’est pourquoi nous
avons décidé de recommencer cette expérience en prenant soin d’étudier l’expression
génique des fibroblastes issus de prépuces d’une part, ceux issus de seins d’autre part
afin d’éliminer les variations liées au tissu.
Figure 40: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression des chaînes 1 et 2(IV) par les fibroblastes dermiques humains issus de prépuces et de seins au cours du vieillissement
Les fibroblastes dermiques étudiés ont été isolés à partir de biopsies de patients regroupés en 5 tranches d’âge: 1-10 ans (n=8), 11-20 ans (n=5), 41-50 ans (n=2), 51-60 ans (n=2) et 61-70 ans
(n=7). L’expression des chaînes 1 et 2(IV) a été analysée par PCR en temps réel.
* * * *
D. Résultats
108
I-2-1 Fibroblastes issus de prépuces
Les fibroblastes dermiques ont été isolés à partir de fragments de peau de
patients de 1 à 12 ans (n=14). De très grandes variabilités interindividuelles sont
observées, notamment entre les 3 patients de 2 ans. Il y a une tendance à la diminution,
que nous avons essayé de mettre plus en évidence en regroupant les échantillons par
tranche d’âge, mais aucun résultat significatif ne peut être obtenu du fait des variations
interindividuelles (figure 41).
Figure 41: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes
dermiques humains issus de prépuces au cours du vieillissement Les fibroblastes dermiques étudiés ont été isolés à partir de prépuces de patients regroupés en 3 tranches d’âge : 1-3 ans (n=5), de 7-10 ans (n=3), de 11-12 ans (n=6). L’expression de la chaîne 1(IV) à été analysée par PCR en temps réel.
I-2-2 Fibroblastes issus de seins
I-2-2-1 Niveau génique
Les fibroblastes dermiques ont été isolés à partir de fragments de peau de
patients regroupés en 4 tranches d’âge : 30 à 40 ans (n=3), 41 à 50 ans (n=6), 51 à 60
D. Résultats
109
ans (n=5), de 61 à 70 ans (n=12). La chaîne 1(IV) est exprimée plus fortement dans la
tranche d’âges 30-40 ans, puis une baisse d’expression de 62% est observée pour la
tranche d’âges 41-50 ans (même si cette dernière n’est pas significative), et cette baisse
est stabilisée dans les tranches d’âges supérieures (74 et 80% de baisse pour les tranches
d’âges 51-60 et 61-70 ans respectivement (figure 42). Du fait des très grandes variations
interindividuelles, les résultats ne sont que faiblement significatifs
Figure 42: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les
fibroblastes dermiques humains issus de seins au cours du vieillissement Les fibroblastes dermiques étudiés ont été isolés à partir de fragments de seins de patients regroupés en 4 tranches d’âge: 30-40 ans (n=3), de 41-50 ans (n=6), 51-60 ans (n=5) et 61-70 ans (n=12.) L’expression de la chaîne 1(IV) à été analysée par PCR en temps réel.
I-2-2-2 Niveau protéique
Pour confirmer cette tendance à la diminution d’expression de collagène IV par
les fibroblastes dermiques au cours du vieillissement, nous avons réalisé un dosage
E.L.I.S.A à partir de milieux conditionnés de culture de fibroblastes issus de seins de
patients de 39, 54, 73 et 81 ans. Une baisse de 62.5% de la concentration en collagène
IV est observée entre les milieux conditionnés issus de patients de 39 ans et de 54 ans.
D. Résultats
110
Entre les deux extrêmes 39 et 81 ans, la baisse de concentration en collagène IV est de
plus de 90% (figure 43).
Figure 43: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de la production de collagène IV par les fibroblastes dermiques humains
Les milieux conditionnées de fibroblastes issus de 4 patients d’âges différents ont été mis en présence des anticorps anti-collagène IV couplé à de la biotine. Puis de l’avidine-HRP est ajouté et la révélation se fait par ajout du substrat TMB. La lecture de l’absorbance se fait à 450 nm.
Les variations interindividuelles importantes vont rendre très difficile l’étude du
mécanisme impliqué dans la diminution de collagène IV au cours du vieillissement
puisque nous avons observé que certains fibroblastes de patients de 60 ans exprimaient
plus de collagène IV que ceux de patients de 35 ans. Nous avons donc décidé d’étudier
ce mécanisme dans un modèle de vieillissement présentant moins de variations
interindividuelles.
* *
N.S
D. Résultats
111
II. Miise au poiint d’un modèlle de
viieii ll ll iissement accélléré pour étudiier lla
diimiinutiion de coll llagène IV
II-1 Modèle murin
Nous avons tout d’abord pensé au modèle murin, très utilisé du fait de sa
disponibilité, de son faible coût, du fait que 99 % de ses gènes soient communs avec
ceux de l’homme. De plus, les souris présentent une durée de vie courte, ce qui offre la
possibilité de travailler sur une même souris au cours de son vieillissement. Pour cela,
nous devions d’abord déterminer si la diminution d’expression des chaînes 1, 2, 5
et 6(IV) observée chez l’Homme était également retrouvée au niveau des fibroblastes
dermiques murins. Pour cela, des fibroblastes murins ont été isolés à partir de biopsies
cutanées réalisées sur le dos de souris C57Bl6 ayant subi un vieillissement normal ou
accéléré (senescence accelerated mice ou SAM).
II-1-1 Vieillissement naturel
Nous avons isolé des fibroblastes de souris jeunes (7 semaines) et de souris âgées
(95 semaines). A confluence, l’extraction d’ARN a été réalisée et l’expression des gènes
codant pour les différentes chaînes (IV) analysée par PCR en temps réel.
Nous observons une diminution de 68 % de l’expression des gènes codant pour
1(IV) et de 55 % pour 2(IV) au cours du vieillissement tandis que pour les chaînes
5 et 6(IV), c’est une augmentation de 38 et 86% respectivement qui est observée
(figure 44).
Nous ne pouvons donc pas utiliser ce modèle car les chaînes 5 et 6(IV) ne suivent
pas la même évolution que chez l’humain. Elles semblent « compenser » la diminution
des chaînes 1 et 2(IV).
D. Résultats
112
Figure 44: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression des chaînes 1, 2, 5 et 6(IV) par des fibroblastes dermiques murins prélevés chez des souris âgées de 7 et 95 semaines
Des fibroblastes de souris de 7 et 95 semaines ont été isolés. L’expression génique des
chaînes 1, 2, 5 et 6(IV) à été dosé par PCR en temps réel. L’expérience à été réalisée en triplicata.
II-1-2 Vieillissement accéléré : souris SAM
La souris en sénescence accélérée (SAM, pour Senescence-Accelerated Mouse)
est un modèle de vieillissement établi par une sélection phénotypique à partir d’un pool
génétique des souris d'AKR/J. Parmi les souris SAM, les souris SAMP (Senescence-
Accelerated Mouse Prone) sont considérées actuellement comme un bon modèle de
vieillissement. Avec l'âge, ces animaux montrent des déficits de mémoire et également
une augmentation de marqueurs de stress oxydatif, dans le cerveau et dans plusieurs
organes périphériques.
Dans cette étude, nous avons utilisé des ARN de fibroblastes à P0 provenant de la peau
du dos de souris SAMP et SAMR (Senescence-Accelerated Mouse Resistant) témoin.
Nous constatons que pour les souris présentant un vieillissement accéléré, il n’y a
*** ***
** **
D. Résultats
113
aucune variation significative de l’expression génique des chaînes 1 et 2(IV) (figure
45). Ces souris ne constituent donc pas un bon modèle d’étude.
Figure 45: Etude, par PCR en temps réel, de l’expression des chaînes 1 et 2(IV) par des
fibroblastes dermiques murins provenant de souris SAM
Des fibroblastes de souris SAMR et SAMP ont été isolés. L’expression génique des chaînes 1 et
2(IV) a été mesurée par PCR en temps réel. L’expérience à été réalisée en triplicata.
II-2 Modèle humain
II-2-1 Vieillissement par passages successifs
Le modèle de vieillissement des fibroblastes par passages successifs est
représentatif du vieillissement chronologique puisqu’il s’agit d’induire la sénescence
réplicative du fibroblaste (sénescence induite par réduction progressive des extrémités
télomériques). Il suffit de faire proliférer des fibroblastes in vitro dans des boites de
culture en utilisant des conditions nutritionnelles et d’oxygénation précises. Nous avons
alors effectué des “passages” successifs: lorsque les cellules ensemencées sont arrivées
à confluence par multiplication mitotique, il suffit de les “repiquer” pour obtenir un
nouveau “passage” et de nouvelles mitoses, ainsi de suite… Pour un passage donné, le
nombre des mitoses reste limité. En effet, lorsque les cellules atteignent la confluence et
forment un tapis continu au fond de la boite, le mécanisme d’inhibition de contact
stoppe l’entrée des fibroblastes dans le cycle réplicatif. La théorie de Hayflick nous
apprend que le nombre des passages est limité pour un fibroblaste normal (environ 65
passages chez l’Homme soit environ 180 à 200 mitoses successives). En effet, la perte
progressive des télomères à chaque mitose induira l’arrêt irréversible du cycle cellulaire
et la cellule entrera en sénescence.
Nous avons donc commencé à travailler avec des fibroblastes issus de patient de 10 ans
et nous les avons cultivés jusqu’au 10ème passage. Dans un premier temps nous avons
D. Résultats
114
vérifié que les cellules à passage 10 peuvent réellement être considérées comme
« vieillies » en étudiant l’expression de gènes témoins de la sénescence réplicative.
L’expression de collagène I est décrite comme diminuant au cours du vieillissement,
alors que celle de la MMP-1 augmente.
Dans un second temps, nous avons étudié l’expression du collagène IV afin de vérifier
qu’elle se comporte comme lors du vieillissement physiologique.
II-2-1-1 Mise en évidence du phénotype sénescent
II-2-1-1-1 Etude de la morphologie
D’un point de vue morphologique, une cellule entrant en sénescence devient
plus étalée, avec un noyau plus large et un volume cytoplasmique accru. Des
modifications du cytosquelette sont à l’origine de cette morphologie caractéristique. Des
fibroblastes issus d’un patient de 10 ans ont étés cultivés jusqu’au passage 15. La
morphologie des cellules au 6ème passage a été comparée à celle des fibroblastes au
15ème passage. Une morphologie caractéristique des cellules à p15 est observée ; les
cellules sont plus volumineuses et plus étalées (figure 46).
Figure 46: Observation morphologique, par microscopie optique, des fibroblastes dermiques cultivés aux passages 6 et 15 (objectif x40)
Les fibroblastes issus d’un patient de 10 ans et cultivés à passage 6 et 15 ont été observés au microscope optique à l’objectif 40.
D. Résultats
115
II-2-1-1-2 Observation de l’activité de la SA -Galactosidase
Hormis l’accroissement de taille, une autre caractéristique phénotypique des
cellules sénescentes est l’augmentation du nombre et du volume des lysosomes (Lee,
Han et al. 2006).
La β-galactosidase est naturellement présente dans les lysosomes. Bien que son activité
soit optimale à pH 4, il a été proposé qu’une activité résiduelle existe à pH 6. Ainsi, du
fait de l’augmentation de la quantité de lysosomes, donc de β-galactosidase, cette
activité devient détectable dans les cellules sénescentes. A partir de fibroblastes prélevés
chez un patient de 7 ans, la quantité de cellules sénescentes est plus élevée chez les
fibroblastes à p15 par rapport à p7 (figure 47).
Figure 47: Observation, par microscopie optique, de l’activité de la SA- galactosidase de fibroblastes dermiques cultivés à p7 et p15.
Les fibroblastes issus d’un patient de 10 ans et cultivés jusqu’au passage 15 ont été mis en contact du substrat X-gal à pH6 et observés au microscope optique à l’objectif 20.
Comme précédemment, nous avons extrait l’ARN des fibroblastes puis étudié
l’expression des gènes d’intérêt par PCR en temps réel. Pour cette étude, nous avons
utilisé RPS29 comme gène de ménage car l’expression de la GAPDH varie au cours des
passages successifs.
D. Résultats
116
II-2-1-1-3 Etude de l’expression de collagène I
Le collagène I est bien connu pour sa diminution d’expression au cours du
vieillissement physiologique. Entre le 4ème et le 10ème passage, il y a une diminution de
42% de l’expression génique du collagène I par les fibroblastes (figure 48).
Figure 48: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(I) par les fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. Les fibroblastes sont issus d’un patient de 10 ans et cultivés jusqu’au passage 10. L’expression de
la chaîne 1 (IV) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisé avec le géne de ménage RPS29. L’expérience a été réalisée en triplicata.
II-2-1-1-4 Etude de l’expression de la MMP-1
La MMP-1 est connue comme augmentant lors d’un vieillissement
chronologique. Cependant, il s’avère que dans ce modèle, nous observons une
diminution de son expression de 78% entre les passages 4 et 10 (figure 49).
Figure 49 : Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la MMP-1 par les fibroblastes dermiques cultivés aux passages 4 et 10.
Les fibroblastes sont issus d’un patient de 10 ans et cultivés jusqu’au passage 10. L’expression de la MMP-1 a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le géne de ménage RPS29. L’expérience a été réalisée en triplicata.
***
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
4 10
M M
P -1
/R P
S 2
9
nombre de passages
***
Nombre de passages
D. Résultats
117
II-2-1-1-5 Etude de l’expression de gènes associés à la sénescence
4 gènes sont connus comme augmentant au cours de la sénescence, c’est
pourquoi ils sont souvent étudiés pour vérifier l’induction ou non du vieillissement
cellulaire.
Il s’agit de gènes codant pour la fibronectine, l’ostéonectine, la smooth muscle 22
(SM22) et l’apoprotéine J (Dumont et coll, 2000). Entre les passages 4 et 10, il y a une
augmentation significative de l’expression de ces 4 gènes (de 30%, 47%, 26% et 42%
respectivement) (figure 50).
Figure 50: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de gènes associés à la senescence
par les fibroblastes dermiques cultivés aux passages 4 et 10. Les fibroblastes sont issus d’un patient de 10 ans et cultivés jusqu’au passage 10. L’expression génique de l’apoprotéine J, de la SM22, de la fibronectine et de l’ostéonectine a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le géne de ménage RPS29. L’expériencea à été réalisée en triplicata.
II-2-1-1-6 Etude de l’expression de gènes associés au cycle cellulaire
Comme démontré par l’équipe de Furukawa en 2007, lors de la sénescence, p53
est activée et cela induit une augmentation de p21WAF-1 qui est responsable de l’arrêt du
cycle cellulaire par blocage des complexes cyclines/CDK.
D. Résultats
118
Nous observons une augmentation significative de 52,5% de l’expression génique de
p21WAF-1, ce qui témoigne de l’arrêt du cycle cellulaire. p53 ne varie pas de manière
significative (figure 51).
Figure 51: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de p21
WAF-1 et de p53 par les fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. Les fibroblastes sont issus d’un patient de 10 ans et cultivés jusqu’au passage 10. L’expression génique de p21WAF-1 et de p53 a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normailisés avec le géne de ménage RPS29. L’expérience à été réalisée en triplicata.
II-2-1-2 Etude de l’expression du collagène IV
Nous avons donc montré que les fibroblastes présentent un phénotype sénescent
à passage 10. Nous avons, par la suite, vérifié que l’expression du collagène IV suivait
bien la même évolution que lors d’un vieillissement naturel.
II-2-1-2-1 Expression génique des chaînes 1 et 2(IV)
L’expression génique des chaînes 1 et 2(IV) diminue respectivement de 60 et
86% entre les passages 4 et 10 (figure 52). Ce modèle de vieillissement suit donc la
même variation d’expression génique que lors d’un vieillissement chronologique. La
dernière étape nécessaire à la validation du modèle est de vérifier que l’expression
protéique diminue également au cours de cette sénescence réplicative.
N.S
D. Résultats
119
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
4 10
ch aî
n e
1
(I V
) /
R P
S2 9
nombre de passages
Figure 52: Etude, par PCR temps réel, de l’expression des chaînes 1 et 2(IV) par les fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. Les fibroblastes sont issus d’un patient de 10 ans et cultivés jusqu’au passage 10. L’expression génique des chaînes 1 et 2(IV) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le géne de ménage RPS29. L’expérience a été réalisée en triplicata.
II-2-1-2-2 Expression protéique du collagène IV
II-2-1-2-2-1 Par western-blot
Nous avons réalisé des western-blots de la chaîne 1(IV) à partir des milieux
conditionnées de fibroblastes issus de patients de 10 ans (fibroblastes utilisés pour
l’étude de l’expression génique) à passage 4 et à passage 15. Il n’y a pas de variation
significative de l’expression protéique de collagène IV entre le 4ème et le 15ème passage
(figure 53). Ce résultat n’est pas corrélé à la diminution d’expression génique retrouvée
entre le 4ème et le 10ème passage. Il ne reflète pas non plus la diminution d’expression
observée dans les conditions de vieillissement physiologique.
Figure 53: Etude, par western-blot, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes
dermiques cultivés aux passages 4 et 10. Les fibroblastes sont issus d’un patient de 10 ans et cultivés jusqu’à passage 10. L’expression protéique de la chaîne 1(IV) a été analysée par western blot (50 µg de protéines totales ont été déposés sur un gel contenant 7.5% d’acrylamide). La quantification relative se mesure par la ratio de la bande d’interêt sur la quantité de protéines totales contenue dans les échantillons.
***
0
0,02
0,04
0,06
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0,1
0,12
4 10
ch a
în e
2 (I
V )
/R P
S2 9
nombre de passages
***
D. Résultats
120
Pour vérifier que le résultat obtenu n’est pas dépendant du patient étudié, nous
avons réalisé cette étude de la variation protéique de la chaîne 1(IV) sur des
fibroblastes provenant de divers patients.
Les milieux conditionnés de fibroblastes provenant de patients de 2 ans ont été collectés
à passage 4 et comparés à ceux collectés à passage 9 ; d’autres milieux ont étés collectés
à partir de fibroblastes de patients de 79 ans et comparés à passage 4 et 10. Nous
n’observons pas non plus de variations majeures de l’expression protéique de la chaîne
1(IV) dans ces deux séries de fibroblastes (figure 54).
Figure 54: Etude, par western-blot, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes dermiques issus de patients âgés de 2 et 79 ans à différents passages
Les fibroblastes sont issus d’un patient de 2 ans et cultivés à passage 4 et 9 et d’un patient de 79 ans et cultivés à passage 4 et 10. L’expression protéique de la chaîne 1(IV) a été analysée par western blot (50 µg de protéines totales ont été déposés sur un gel contenant 7.5% d’acrylamide). La quantification relative se mesure par la ratio de la bande d’interêt sur la quantité de protéines totales contenue dans les échantillons.
II-2-1-2-2-2 Par dosage ELISA
Le contenu en collagène IV des milieux conditionnés provenant de fibroblastes
issus de patients de 10 ans (p4 et p15) ont été dosés par ELISA. Il n’y a pas de variation
D. Résultats
121
significative de la concentration de collagène IV (458 pg/mL à p4 et 440 pg/mL à p15)
(figure 55). Nous excluons donc ce modèle pour l’étude de la variation du collagène IV
étant donné que nous ne retrouvons pas la diminution protéique observée lors du
vieillissement chronologique.
Figure 55: Etude, par dosage ELISA, de la production de collagène IV par fibroblastes dermiques cultivés aux passages 4 et 10.
Les milieux conditionnées de fibroblastes issus d’un patient de 10 ans et cultivés à passage 4 et 10 ont été mis en présence des anticorps anti-collagène IV couplé à de la biotine. Puis de l’avidine-HRP est ajouté et la révélation se fait par ajout du substrat TMB. La lecture de l’absorbance se fait à 450 nm.
II-2-2 Sénescence prématurée induite par le stress
Après abandon du précédent modèle, nous avons donc décidé de mettre au point
un modèle de vieillissement des fibroblastes par SIPS (senescence induite par un stress).
Nous avons testé deux types de stress : l’un est inspiré des travaux de Dmitrieva et Burg
en 2007 et consiste à traiter les cellules avec de fortes concentrations en chlorure de
sodium ; l’autre est le modèle de vieillissement des fibroblastes par des doses élevées
mais non létales de peroxyde d’hydrogène, modèle le plus utilisé. Voici un tableau
récapitulatif des différentes séries de fibroblastes utilisées pour cette étude.
Pour le stress induit par traitement avec H2O2, les doses utilisées vont de 50 à
200 µM (figure 56).
D. Résultats
122
Figure 56: Récapitulatif du traitement des fibroblastes avec H2O2
Les fibroblastes sont traités 1h30 avec 0 à 200 µM d’ H2O2. les cellules sont ensuite rincées et le milieu est remplacé par un milieu neuf sans sérum pendant 48h.
Pour le stress induit par traitement au NaCl, nous avons traité avec des doses
finales de 200 à 300 mM, la dose témoin contenu dans le milieu de culture étant de 150
mM (figure 57).
Figure 57: Récapitulatif du traitement des fibroblastes avec NaCl
Les fibroblastes sont incubés pendant 14 jours avec 150 à 300 mM de NaCl. Le milieu est renouvelé le 7ème jour. Le 12ème jour le milieu est remplacé par un milieu sans sérum pendant 48h.
II-2-2-1 Test de viabilité au bleu trypan
Nous avons tout d’abord vérifié quelles concentrations en H2O2 et NaCl
pouvaient être utilisées sans qu’il y ait apparition de toxicité. Pour cela, nous avons
réalisé des tests de viabilité cellulaire au bleu trypan. Pour les fibroblastes traités avec le
peroxyde d’hydrogène, nous avons testé la viabilité sur 9 séries de cellules et calculé le
pourcentage moyen de viabilité en fonction de la dose d’H2O2 utilisé (figure 58). Nous
avons alors décidé de sélectionner la dose de 100 µM d’H2O2 puisqu’au-delà, la
mortalité est supérieure à 5% (15% et 23% pour 150 et 200 µM respectivement).
D. Résultats
123
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200
p o
u rc
e n
ta ge
d e
v ia
b ili
té
[H2O2] (µM)
Figure 58: Mesure, par coloration au bleu trypan, de la viabilité des fibroblastes dermiques traités avec 0 à 200 µM d’H2O2
La viabilité des cellules traitées avec 0 à 200 µM d’ H2O2 est mesurée par le test au bleu trypan. Le bleu trypan est ajouté au culot cellulaire (à volume égal), 10 µL sont déposés sur lame placée sur un appareil de comptage automatique. (Etude réalisée sur 6 séries de fibroblastes issus de patients de 1 an, 2 ans, 5 ans et 48 ans et utilisés avant le 5ème passage).
Pour les fibroblastes traités avec le chlorure de sodium, les tests de viabilité ont
été réalisés sur 6 séries de fibroblastes (figure 59). Nous avons décidé de sélectionner la
dose de 225 mM de NaCl puisqu’au-delà, la mortalité est supérieure à 5% (17,5% et
32% pour 250 et 300 mM respectivement).
0
20
40
60
80
100
120
150 200 225 250 300
p o
u rc
e n
ta ge
d e
v ia
b ili
té
[NaCl] (mM)
Figure 59: Mesure, par coloration au bleu trypan, de la viabilité des fibroblastes dermiques traités
avec 150 à 300 mM de NaCl La viabilité des cellules incubées en présence de 150 à 300 mM de NaCl est mesurée par le test au bleu trypan. Le bleu trypan est ajouté au culot cellulaire (à volume égal), 10 µL sont déposés sur lame placée sur un appareil de comptage automatique. (Etude réalisée sur 5 séries de fibroblastes issus de patients de 1 an, 2 ans, 4 ans, 5 ans et 48 ans et utilisés avant le 5ème passage).
D. Résultats
124
II-2-2-2 Mise en évidence du phénotype sénescent
II-2-2-2-1 Etude de la morphologie
La première chose à faire pour vérifier l’induction de la sénescence aux doses
sub-toxiques déterminées est donc l’observation microscopique des cellules.
Les cellules traitées avec 100 µM d’ H2O2 présentent une morphologie
caractéristique des cellules sénescentes. Elles sont plus grandes, plus larges et plus
étalées que les fibroblastes contrôles fusiformes (figure 60).
Figure 60: Observation morphologique, par microscopie optique, des fibroblastes dermiques
humains traités avec des doses croissantes d’H2O2
(objectif x40) Les fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus d’un patient de 5 ans et utilisés avant le 5ème passage ont été observés au microscope optique à l’objectif 40.
Les cellules traitées avec 225 mM de NaCl présentent également cette
morphologie caractéristique (figure 61).
D. Résultats
125
Figure 61: Observation morphologique, par microscopie optique, des fibroblastes dermiques traités avec des doses croissantes de NaCl (objectif x40)
Les fibroblastes contrôles (incubés en présence de 150 mM de NaCl) et incubés en présence de 225 mM de NaCl issus d’un patient de 4 ans et utilisés avant le 5ème passage ont été observés au microscope optique à l’objectif 40.
II-2-2-2-2 Observation de l’activité de la SA--Galactosidase
Les fibroblastes traités avec 100 µM d’H2O2 présentent la coloration
caractéristique des cellules sénescentes alors que les contrôles en présentent peu (figure
62).
Figure 62: Observation, par microscopie optique, de l’activité de la SA- galactosidase de fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 (objectif x 10)
Les fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus d’un patient de 5 ans et utilisés avant le 5ème passage ont été mis en contact du substrat X-gal à pH6 et observés au microscope optique à l’objectif 10.
D. Résultats
126
Les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl présentent bien la coloration
caractéristique des cellules sénescentes alors que les cellules contrôles ne présentent pas
de coloration (figure 63). Ce résultat confirme nos observations sur les changements
morphologiques et l’état de sénescence des fibroblastes.
Figure 63: Observation, par microscopie optique, de l’activité de la SA- galactosidase de fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl (objectif x 10)
Les fibroblastes contrôles (incubés en présence de 150 mM de NaCl) et incubés en présence de 225 mM de NaCl issus d’un patient de 1 an et utilisés avant le 5ème passage ont été mis en contact du substrat X-gal à pH6 et observés au microscope optique à l’objectif 10.
Comme pour le modèle de sénescence réplicative, nous avons vérifié l’induction
de la sénescence en étudiant l’expression de gènes connus pour varier lors du
vieillissement. Cette étude est réalisée par PCR en temps réel.
II-2-2-2-3 Etude de l’expression de collagène I
Nous avons donc étudié l’expression génique du collagène de type I par les
fibroblastes provenant de 3 patients différents pour le modèle avec H2O2 et 3 autres
patients pour le modèle avec NaCl.
Pour les 3 séries de fibroblastes testées, nous observons une diminution
d’expression du collagène I. Il y a une diminution de 90% entre les fibroblastes
contrôles et ceux traités avec 100 µM d’ H2O2 pour les fibroblastes issus de patients de
2 ans (F2), 54% pour les fibroblastes issus de patients de 5 ans (F5) et 88% pour
fibroblastes issus de patients de 48 ans (F48) (figure 64).
D. Résultats
127
Figure 64: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(I) par les fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus de patients de 2 ans, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage.
L’expression génique de la chaîne 1(I) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
Pour les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl, nous observons également
une diminution significative d’expression du collagène I entre les fibroblastes contrôles
et ceux traités avec 225 mM. Une diminution de 43% pour les fibroblastes issus de
patients de 1 an (F1), 19% pour les fibroblastes issus de patients de 5 ans (F5), et 94%
pour les fibroblastes issus de patients de 48 ans (F48) (figure 65).
Les fibroblastes issus de patients les plus âgés réagissent davantage à l’induction
de sénescence puisque la diminution d’expression est plus importante.
Figure 65: étude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(I) par les fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et incubés avec 225 mM de NaCl issus de patients de 1 an, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage.
L’expression génique de la chaîne 1(I) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
II-2-2-2-4 Etude de l’expression de la MMP-1
D. Résultats
128
Nous observons une augmentation significative de l’expression de MMP-1 par
les fibroblastes traités avec 100 µM d’H2O2 par rapport aux fibroblastes contrôles.
L’augmentation est de 122% pour les F2, 20% pour les F5 et 354% pour les F48 (figure
66).
Figure 66: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la MMP-1 par les fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus de patients de 2 ans, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage (Toutes les études en PCR temps réel sur
ce modèle de vieillissement ont été réalisées à partir de ces 3 séries de fibroblastes). L’expression génique de la MMP-1 a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
Une augmentation significative de l’expression de la MMP-1 est également
observée pour les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl. L’augmentation est de 84%
pour les F2, de 477% pour les F5 et de 3000% pour les F48 (figure 67). Une fois de plus
les fibroblastes issus des patients les plus âgés répondent de façon plus importante au
traitement.
Figure 67: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la MMP-1 par les fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et incubés avec 225 mM de NaCl issus de patients de 1 an, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage. (Toutes les études en PCR temps réel
sur ce modèle de vieillissement ont été réalisées à partir de ces 3 séries de fibroblastes). L’expression génique de la MMP-1 a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
D. Résultats
129
II-2-2-2-5 Etude de l’expression de gènes associés au cycle cellulaire
La sénescence (réplicative ou induite par un stress) est essentiellement induite
par la voie de signalisation p53/p21WAF-1. C’est pourquoi nous avons décidé de vérifier
leur variation d’expression génique dans les deux modèles de vieillissement.
Il y a une augmentation de 72% de l’expression génique de p21WAF-1 dans les F5
traités avec 100 µM d’H2O2. Le résultat est cohérent avec le phénotype sénescent des
cellules puisque le cycle cellulaire est stoppé en phase G1 lors d’une augmentation de
p21WAF-1. Aucune variation de l’expression de p53 n’est observée dans les fibroblastes
traités. Ceci peut s’expliquer par le fait que, lors de la sénescence, c’est l’activité de p53
qui augmente, suite à l’augmentation de p21WAF-1, et non l’expression génique (figure
68).
Figure 68: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de p53 et p21
WAF-1 par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus de patients de 5 ans utilisés avant le 5
ème passage. L’expression génique de p53 et p21WAF-1 a été analysée par PCR
en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
Pour les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl dans les F1, il n’y pas de
variation significative de l’expression génique de p21WAF-1 et de p53 (figure 69). Pour ce
type de stress, l’arrêt du cycle cellulaire n’est peut-être pas dû à l’axe p53/p21 mais à
une voie parallèle. En effet, dans les cellules rénales c’est une augmentation
d’expression de p16INK-4a qui est observé lors d’une sénescence induite par NaCl
(Dmitrieva et Burg, 2007). Nous avons donc essayé de mettre au point des amorces
spécifiques de ce gène mais, du fait de sa taille extrêmement petite, les choix ont été très
restreints et les 2 couples d’amorces dessinées, malgré le respect de tous les critères
D. Résultats
130
nécessaires, ne nous ont pas permis d’amplifier ce gène dans les fibroblastes traités avec
NaCl.
Figure 69: étude, par PCR temps réel, de l’expression de p53 et p21 par les fibroblastes
dermiques traités avec 225 mM de NaCl L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et incubés avec 225 mM de NaCl issus de patients de 1 an utilisés avant le 5
ème passage.
L’expression génique de p53 et p21WAF-1 a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
Nous avons donc montré que les fibroblastes dermiques traités avec soit
100 µM d’H2O2, soit 225 mM de NaCl entraient en sénescence accélérée. L’étape
suivante pour la validation de ces modèles de vieillissement pour l’étude de l’expression
du collagène IV était donc de vérifier que l’expression génique et protéique de ce
collagène suivait bien la même évolution que lors d’un vieillissement chronologique.
II-2-2-3 Etude de l’expression génique du collagène IV
II-2-2-3-1 Expression génique
II-2-2-3-1-1 La chaîne 1(IV)
Les fibroblastes traités avec 100 µM d’H2O2 présentent une diminution
d’expression de la chaîne 1(IV) significative de 97% pour les F2, 50% pour les F5 et
51% pour F48 (Figure 70).
N.S N.S
D. Résultats
131
Figure 70: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus de patients de 2 ans, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage.
L’expression génique de la chaîne 1(IV) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
Nous retrouvons également une diminution d’expression génique significative
chez les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl (43% pour les F1, 32% pour les F5 et
84% pour les F48) (figure 71).
Figure 71: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les
fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et incubés avec 225 mM de NaCl issus de patients de 1 an, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage.
L’expression génique de la chaîne 1(IV) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
II-2-2-3-1-1 La chaîne 2(IV)
L’expression de la chaîne 2(IV) diminue significativement entre les
fibroblastes contrôles et ceux traités avec 100 µM d’H2O2. Cette diminution est de
76,5% pour les F2, 73% pour les F5 et 57% pour les F48 (figure 72).
D. Résultats
132
Figure 72: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 2(IV) par les fibroblastes
dermiques traités avec 100 µM d’H2O2 L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus de patients de 2 ans, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage.
L’expression génique de la chaîne 2(IV) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
Les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl présentent également une
diminution d’expression par rapport aux fibroblastes contrôles (150 mM). Cependant
elle n’est significative que pour les F1 (64%). Pour F5 la diminution est de 16% et pour
F48 elle est de 10% (figure 73).
Figure 73: Etude, par PCR temps réel, de l’expression de la chaîne 2(IV) par les fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et incubés avec 225 mM de NaCl issus de patients de 1 an, de 5 ans et de 48 ans utilisés avant le 5
ème passage.
L’expression génique de la chaîne 2(IV) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le géne de ménage GAPDH. L’expérience à été réalisée en triplicata.
Nous avons, pour les deux modèles de vieillissement, prouvé que l’expression
génique des deux principales chaînes du collagène IV suivait la même évolution que
lors d’un vieillissement chronologique. Il restait à vérifier que l’expression protéique
évoluait de la même manière.
D. Résultats
133
II-2-2-3-2 Expression protéique
II-2-2-3-2-1 Par western-blot
Nous avons analysé par western-blot les milieux conditionnés de fibroblastes
traités avec H2O2 et NaCl.
Pour les 3 séries de fibroblastes traités par 100 µM d’H2O2, il y a une diminution de la
bande de 180 kDa correspondant à la chaîne 1(IV). La quantification des bandes
rapportées aux protéines totales montre que pour les 2 séries de fibroblastes de 2 ans
(P2(1) et P2(2)) la diminution est située entre 40 et 70%. La diminution est de 65% pour
les F5 (figure 74).
Ce modèle peut donc être utilisé pour l’étude du mécanisme impliqué dans la
diminution de collagène IV puisqu’il s’approche du vieillissement physiologique.
Figure 74: Etude, par western-blot, de l’expression de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus de patients de 2 ans et de 5 ans utilisés avant le 5
ème passage.(la seconde série de fibroblastes issus d’un patient
de 2 ans et la serie issue d’un patient de 5 ans correspondent à celles étudiées en PCR en temps
réel pour ce modèle de vieillissement). L’étude de l’expression protéique de la chaîne 1(IV) a été réalisée par la technique de western-blot (50 µg de protéines totales ont été déposés sur un gel contenant 7.5% d’acrylamide). La quantification relative se mesure par la ratio de la bande d’interêt sur la quantité de protéines totales contenue dans les échantillons.
D. Résultats
134
Pour le modèle de vieillissement induit par 225 mM de NaCl, aucune variation
d’expression protéique n’a pu être détectée que ce soit avec un anticorps dirigé contre le
collagène IV total ou la chaîne 1(IV) (figure 75). Nous ne pouvons donc pas valider ce
modèle pour l’étude du mécanisme impliqué dans la régulation de collagène IV
puisqu’il ne reproduit pas la diminution observée dans les conditions physiologiques
lors du vieillissement.
Figure 75: Etude, par western-blot, de l’expression du collagène IV par les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl
L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et incubés avec 225 mM de NaCl issus de patients de 5 ans utilisés avant le 5
ème passage (Cette série de fibroblastes correspond à celle étudiée en
PCR en temps réel sur ce modèle de vieillissement). L’étude de l’expression protéique de la chaîne 1(IV) a été réalisée par la technique de western-blot (50 µg de protéines totales ont été déposés sur un gel contenant 7.5% d’acrylamide). La quantification relative se mesure par la ratio de la bande d’interêt sur la quantité de protéines totales contenue dans les échantillons.
.
D. Résultats
135
II-2-2-3-2-1 Par dosage E.L.I.S.A
Afin de confirmer les résultats obtenus par western-blot, nous avons réalisé un
dosage E.L.I.S.A sur une série de fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl et une autre
traitée avec 100 µM d’H2O2. L’expression protéique de collagène IV diminue de 82%
avec le traitement à 100 µM d’H202 (figure 76).
Figure 76: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de la production de collagène IV par les fibroblastes dermiques traités avec 100 µM d’H2O2
Les milieux conditionnées de fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM H2O2 issus de patients de 2 ans utilisés avant le 5
ème passage ont été mis en présence des anticorps anti-
collagène IV couplé à de la biotine. Puis de l’avidine-HRP est ajouté et la révélation se fait par ajout du substrat TMB. La lecture de l’absorbance se fait à 450 nm.
Il n’y a pas de variations significatives de la concentration de collagène IV
lorsque les cellules sont traitées avec 225 mM de NaCl par rapport aux cellules
contrôles (figure 77).
Figure 77: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de la production de collagène IV par les fibroblastes dermiques traités avec 225 mM de NaCl
Les milieux conditionnées de fibroblastes contrôles et incubés avec 225 mM de NaCl issus de patients de 2 ans utilisés avant le 5
ème passage ont été mis en présence des anticorps
anti-collagène IV couplé à de la biotine. Puis de l’avidine-HRP est ajouté et la révélation se fait par ajout du substrat TMB. La lecture de l’absorbance se fait à 450 nm.
**
D. Résultats
136
III. Effet du TGF-1 sur ll ’expressiion du
coll llagène IV par lles fiibrobllastes dermiiques
humaiins contrôlles et sénescents
Le TGF-1 augmente l’expression du collagène IV dans les cellules mésangiales
et les fibroblastes NIH 3T3, mais rien n’a été publié concernant les fibroblastes
dermiques humains. Nous avons donc étudié l’effet du TGF-1 sur l’expression du
collagène IV par les fibroblastes dermiques humains dans les conditions physiologiques
et dans des conditions de stress induites par 100 µM d’H2O2.
III-1 Etude de l’effet dose du TGF-1 sur les fibroblastes contrôles
Les cellules sont cultivées pendant 48 heures en absence de SVF et en présence
de concentrations croissantes de TGF-ß1 (0,5 à 20 ng/mL). Les ARN sont quantifiés par
PCR en temps réel et les milieux conditionnés sont collectés pour réaliser le western-
blot.
L’expression des chaînes 1 et 2 augmente de manière statistiquement
significative dès 2,5 ng/mL de TGF-ß1. L’effet maximum est obtenu pour une
concentration de 10 ng/mL pour 1(IV) (augmentation de 20 fois par rapport aux
fibroblastes non traités) et pour 2(IV) (augmentation de 10 fois) puis il diminue à
nouveau pour une concentration de 20 ng/mL. On note une valeur abhérante pour la
chaîne 2 en présence de 5 ng/mL de TGF-ß1.
Le western-blot met en évidence une bande de 250 kDa, correspondant au collagène IV
natif.
Au niveau protéique, la différence d’expression n’est pas aussi prononcée qu’au niveau
transcriptionnel. Il y a une augmentation progressive de la synthèse de collagène IV qui
atteint un plateau dès 2,5 ng/mL jusqu’à 10 ng/mL (50% d’augmentation de la synthèse
de collagène IV), puis il y a une diminution à 20 ng/mL (l’augmentation observée n’est
plus que de 18%) (figure 78).
D. Résultats
137
Suite aux résultats obtenus en PCR et en western-blot, nous avons choisi de nous
placer à la concentration de 10 ng/mL de TGF-ß1 pour les expériences de vieillissement
accéléré.
Figure 78: Effet dose du TGF-ß1 sur l’expression du collagène de type IV dans des fibroblastes
dermiques humains A : L’étude a été réalisée sur fibroblastes traités avec 0 à 20 ng/ml de TGF-ß1 issus de patients de
1 an utilisés avant le 5 ème
passage. L’expression génique des chaînes 1 et 2(IV) a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata. B : L’étude a été réalisée sur fibroblastes traités avec 0 à 20 ng/ml de TGF-ß1 issus de patients de 1 an utilisés avant le 5
ème passage. L’expression protéique du collagène I a été analysée par la
technique de western-blot (50 µg de protéines totales ont été déposés). La quantification relative se mesure par la ratio de la bande d’interêt sur la quantité de protéines totales contenue dans les échantillons.
III-2 Effet de l’anticorps bloquant anti-TGF-1 sur la synthèse de collagène
IV par les fibroblastes dermiques.
Nous avons traité les fibroblastes dermiques avec un anticorps bloquant du TGF-
puis avec ou sans TGF-afin de vérifier dans un premier temps l'efficacité de cet
anticorps. La bande de 250 kDa correspondant au collagène IV total est bien inhibée
A
B
D. Résultats
138
lorsque les cellules sont incubées en présence d’anticorps bloquant puis de TGF-1,
nous permettant alors de valider l’effet de cet anticorps (figure 79).
Figure 79: Effet de l’anticorps bloquant du TGF- sur la synthèse de collagène IV par les fibroblastes dermiques humains
Les fibroblastes issus de patients de 2 ans et utilisés avant le 5 ème
passage ont été traités avec 10
µg/ml d’anticorps bloquants du TGF-puis plus ou moins 10 ng/ml de TGF-les fibroblastes contrôles n'ont été traités avec aucun de ces deux composés. L’expression protéique du collagène I a été analysée par la technique de western-blot (50 µg de protéines totales ont été déposés). La quantification relative se mesure par la ratio de la bande d’interêt sur la quantité de protéines totales contenue dans les échantillons.
III-3 Etude de l’effet du TGF-1 sur les fibroblastes sénescents
Les fibroblastes sont incubés en présence ou en absence de 100 µM d’H2O2
durant 1h30, puis les cellules sont incubées 48h en présence de DMEM sans SVF,
jusqu’à apparition de la sénescence. Les fibroblastes sont alors incubés de nouveau pour
48h en présence ou en absence de TGF-ß1.
L’incubation des fibroblastes sénescents avec le TGF- ß1 (10 ng/mL) augmente
de 272% l’expression de la chaîne 1(IV) par rapport aux fibroblastes sénescents non
traités (figure 80).
D. Résultats
139
Figure 80: Etude, par PCR temps réel, de l’expression du collagène IV par les fibroblastes sénescents
Les fibroblastes issus de patients de 2 ans et utilisés avant le 5 ème
passage ont été traités 1h30 avec 100 µM d’H2O2 puis le milieu a été remplacé par du milieu neuf sans sérum pendant 48h.
L’induction de la sénescence a été vérifiée par étude de l’expression génique de la chaîne 1(IV) par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le géne de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata (A). Les fibroblastes ont ensuite été traités avec du TGF-
1 pendant 48h et l’expression génique de la chaîne 1(IV) par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le gène de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata
D. Résultats
140
IV. Etude du mécaniisme iimplliiqué dans lla
diimiinutiion du coll llagène IV au cours du
viieii ll ll iissement
Il est maintenant bien établi que la diminution du TGF-joue un rôle dans la
diminution de l’expression du collagène de type I au cours du vieillissement. Nous
avons montré que le TGF-régule l’expression de collagène IV par les fibroblastes
non sénescents et sénescents. Nous nous sommes donc intéressés à la voie de
signalisation du TGF-dans notre modèle de sénescence induite par H2O2.
IV-1 Etude des protéines phosphorylées : voie du TGF-1
Nous avons tenté de mettre en évidence des variations de phosphorylation ou
d’expression de protéines impliquées dans la voie du TGF-lorsque la sénescence est
induite par traitement des fibroblastes avec 100 µM d’H2O2 à l’aide d’un kit « protein
array » dédié à la voie du TGF-
A l’aide d’un programme sous Image J permettant de quantifier l’intensité des
spots obtenus et de supprimer les pixels parasites correspondant au bruit de fond, nous
avons pu mettre en évidence des différences d’expression entre les fibroblastes
contrôles et les fibroblastes sénescents.
Le tableau ci-dessous répertorie les protéines pour lesquelles nous avons observé
des variations. L’expression du TGF-1 et du du TGRII diminuent de 27% et 13%
respectivement.
D. Résultats
141
augmentation d'expression
PKC zeta (Ab-410) -36,5
TGF beta receptor II (inter) -27
TGF beta1 (inter) -13
diminution d'expression
Myc (Phospho-Ser373) -25
AKT (Phospho-Ser473) -29
S6K-alpha 6 (Inter) 30,4
RASE (Inter) 19,4
RASF4 (Inter) 32,2
Shc (Ab427) 16,4
PAK1/2/3 (Ab-423/402/421) 37
SEK1/MKK4 (Ab-80) 18,8
Smad3 (Phospho-Ser204) 8,5
Smad2 (Phospho-Ser250) 10,4
MKK6 (Ab-207) 6,8
Abl1 (Phospho-Tyr204) 5,4
AKT1 (Phospho-Ser124) 37,4
p38 MAPK (Phospho-Tyr322) 45,8
PKC theta (Ab-676) 9
Myc (Ab-62) 16,7
Abl1 (Phospho-Tyr412) 6,5
nom de la protéine variation d'expression (en %)
SAPK/JNK (Phospho-Tyr185) 23,3
Rac1/cdc42 (Ab-71) 16,2
Tableau 3: Variation de l’expression de protéines impliquées dans la voie du TGF-lors d’un
traitement avec 0 et 100 µM d’H2O2
Etude réalisée sur fibroblastes issus de patients de 5 ans et utilisés avant le 5ème passage
IV-2 Etude de l’expression du TGF-1 et de son récepteur TGF-RII par des
fibroblastes vieillis artificiellement
Suite aux résultats précédents, nous avons étudié l’expression du TGF-1 et de
son récepteur TRII dans les F1 traités avec 100 µM d’H2O2.
IV-2-1 TGF-1
IV-2-1-1 Expression génique
Nous avons donc étudié l’expression génique du TGF-1 par PCR en temps réel
et comme le montre la figure 86, il n’y a pas de variation significative de son expression
dans les fibroblastes sénescents.
D. Résultats
142
Figure 81: Etude, par PCR temps réel, de l’expression du TGF-par les fibroblastes sénescents L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM d’H2O2 issus de patients de 2 ans utilisés avant le 5
ème passage (Cette série correspond à celle étudié en PCR temps réel dans
ce même modèle de vieillissement). L’expression génique du TGF-1 a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le géne de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
IV-2-1-2 Expression protéique
Après avoir montré que l’expression génique du TGF-1 ne variait pas dans les
fibroblastes sénescents, nous avons décidé d’étudier son expression protéique en
réalisant une étude cinétique de son expression. Pour cela nous avons collecté les
milieux conditionnés de fibroblastes traités avec 100 µM d’ H2O2 depuis la fin du
traitement (t0) jusqu’à 48h et avons dosé leur contenu en TGF-1 par ELISA.
Pour les F5(1), F5(2) et F5(3), la quantité de TGF-1 augmente durant les 2 premières
heures puis elle s’infléchit jusqu’au temps 24 h et évolue ensuite différemment en
fonction de la série (figure 87).
N.S
D. Résultats
143
Figure 82: Etude, par dosage E.L.I.S.A, de l’expression du TGF-1 par les fibroblastes dermiques
humains vieillis artificiellement par traitement avec 100 µM d’H2O2
Les milieux conditionnées de fibroblastes traités avec 100 µM de TGF-1 issus de patients de 5 ans utilisés avant le 5
ème passage ont été mis en présence de l’anticorps anti-collagène
IV couplé à de la biotine. Puis de l’avidine-HRP est ajouté et la révélation se fait par ajout du substrat TMB. La lecture de l’absorbance se fait à 450 nm.
IV-2-2 TRII
Nous avons ensuite étudié l’expression génique du récepteur au TGF-1, appelé
TII, par PCR en temps réel 48h après traitement nous avons montré qu’elle diminue de
35% dans les fibroblastes sénescents (figure 83).
D. Résultats
144
Figure 83 : Etude, par PCR temps réel, de l’expression du TRIIpar les fibroblastes sénescents L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM d’H2O2 issus de patients de 2 ans utilisés avant le 5
ème passage. (Cette série correspond à celle étudié en PCR temps réel dans
ce même modèle de vieillissement). L’expression génique du TGF-RII a été analysée par PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés avec le géne de ménage GAPDH. L’expérience a été réalisée en triplicata.
IV-3 Etude de la voie des Smads.
Lors de l’étude des protéines de la voie du TGF-1, nous avons mis en évidence une
modification de l’expression des phospho-Smads 2 et 3. Nous avons donc tenté de
vérifier ce résultat en réalisant des immunoprécipitations de ces protéines à partir
d’extraits cellulaires de fibroblastes traités ou non avec 100 µM d’H2O2.
Bien qu’a première vue l’augmentation de la phosphorylation de Smad 2 et 3 semble
très augmentée chez les fibroblastes sénescents, les ratios Smad 2 phosphorylée / Smad
2 totale et Smad 3 phosphorylée / Smad 3 ne tendent que vers une faible augmentation.
D. Résultats
145
Figure 84: Etude, par western-blot, de l’expression de smad2 et 3 et de leur forme
phoshoryléepar les fibroblastes sénescents L’étude a été réalisée sur fibroblastes contrôles et traités avec 100 µM d’H2O2 issus de patients de 5 ans utilisés avant le 5
ème passage. 10 µg d’extraits protéiques des fibroblastes ont étés incubés
en présence d’anticorps anti-Smad2/3 puis avec des billes d’agarose couplées aux protéine A et G. Les billes sont ensuite collectées et mélangées à du tampon de charge. L’expression protéique du collagène I a été analysée par la technique de western-blot (50 µg de protéines totales ont été déposées sur gel contenant 10% d’acrylamide). La quantification relative se mesure par la ratio de la bande d’interêt sur la quantité de protéines totales contenue dans les échantillons.
146
E. Discussion
E. Discussion
147
Le collagène de type IV est présent exclusivement au niveau des membranes basales
où il est le composé majoritaire. Il forme un réseau supramoléculaire, sa molécule élémentaire
étant constituée par l’association en triple hélice de 3 chaînes parmi six chaînes possibles
(1 à 6).
Au niveau de la peau, la membrane basale est appelée jonction dermo-épidermique et
est située à l’interface entre l’épiderme et le derme.
Les travaux de Väzquez et coll, mettent en évidence une diminution de collagène IV
corrélée avec l’âge au niveau de la peau de patientes âgées de 35 à 63 ans. Cependant, le
mécanisme n’a pas été déterminé à ce jour. Le but de notre étude était de confirmer cette
diminution de collagène IV au cours du vieillissement et d’étudier le mécanisme impliqué.
Nous avons donc, dans un premier temps, étudié l’expression du collagène de type IV
dans des fragments de peau. Au niveau de peaux provenant de prépuces, l’expression du
collagène IV semble être maximale à 1 an puis diminuer à 2 ans et se stabiliser. Pour les
peaux âgées l’expression protéique de collagène IV diminue au cours du vieillissement entre
35 et 80 ans, confirmant des résultats obtenus par Vazquez et Le Varlet. L’étude de
l’expression génique n’a pas pu être réalisée du fait de la difficulté à maintenir l’intégrité des
ARN puisque les prélevements de peaux ne nous sont pas toujours confiés à la sortie du bloc
opératoire. Cette étude, réalisée sur des extraits de peau totale (derme + épiderme) ne permet
pas de différencier le collagène présent au niveau de la JDE de celui situé au niveau des
vaisseaux sanguins.
Pour analyser les éventuelles discontinuités du collagène IV au niveau de la jonction
dermo-épidermique uniquement, nous avons réalisé des immunomarquages fluorescents du
collagène IV sur coupes de peaux. Pour les peaux jeunes, la JDE est fortement invaginée
tandis que pour les peaux âgées, la JDE s’aplanit et l’épaisseur de l’épiderme diminue
(Levakov et coll, 2012). Nous avons évalué la longueur de la JDE pour une distance donnée et
vérifié qu’elle diminuait au cours du vieillissement. Pour les études suivantes, nous avons
éliminé les échantillons atypiques, c’est-à-dire présentant un écart-type 2 fois supérieur à la
moyenne. Nous n’avons malheureusement pu mettre en évidence de différence significative
sur le continuité du marquage de collagène IV entre les coupes de peaux jeunes et âgées, du
fait des nombreuses variations interindividuelles. Nous n’avons pas pu quantifier le collagène
IV par cette technique du fait de la photoinstabilité de l’alexa fluor. Nous avons donc, dans le
but de quantifier le collagène IV de la JDE, réalisé des marquages immunoenzymatiques sur
coupes de peaux incluses en paraffine et provenant toutes d’une même zone du corps.
E. Discussion
148
Cependant nous ne sommes pas parvenus à mettre en évidence de différences significatives
d’expression du collagène IV au sein de le JDE du fait des variabilités interindividuelles.
Parallèlement aux études immunohistochimiques classiques, nous avons tenté
d’analyser le collagène IV par spectroscopie RAMAN, technique non invasive qui ne
nécessite aucun marquage préalable. Nous avons tenté de mettre en évidence une signature
spectrale du collagène IV en collaboration avec Olivier Piot et The Thuong N-Guyen. L’étude
a tout d’abord été réalisée sur collagène I et collagène IV purs. Elle a permis de mettre en
évidence des différences spectrales entre ces deux types de collagène. En prenant en compte
la normalisation du spectre sur la bande amide I, le contenu en résidus proline et
hydroxyproline apparait plus élevé dans le collagène IV que dans le collagène I. Les
vibrations spécifiques de la phenylalanine sont plus intenses dans le collagène IV, ce qui
traduit une quantité plus importante de cet acide aminé dans la collagène IV mais aussi peut-
être des différences conformationnelles de ces résidus entre les deux protéines. La vibration
correspondant pouvant être attribuée aux liaisons croisées glucosyl-galactosyl-
hydroxylysinonorleucine entre les tropocollagènes présente un pic est plus intense au niveau
du collagène I, ce qui montre un contenu plus important en liaisons croisées dans ce collagène
et est corrélé avec la structure fibrillaire du collagène I. L’information spectrale associée aux
ponts disulfures se situe dans la gamme 500-550 cm-1. En effet, les vibrations d’étirement S-S
du collagène IV apparaissent à 510 et 540 cm-1 et ces signaux sont dus aux ponts disulfures
des domaines 7S et traduit le fait que ces ponts peuvent se trouver dans différents types de
conformation et cette information conformationnelle du domaine 7S peut être utilisée comme
marqueur in situ de la stabilité du réseau de collagène IV. La détemination de la signature
spéctrale du collagène IV permet d’apporter un nouvel outil pour l’étude des altérations
moléculaires de la peau induites par le vieillissement chronologique. L’étude de coupes de
peaux jeunes et âgées a permis de mettre en évidence des différences spectrales entre le derme
et l’épiderme. Pour ce qui est de la jonction dermo-épidermique, il s’avère que les spectres
receuillis ne sont pas uniquement ceux de la JDE mais aussi ceux de l’épiderme et du derme.
En microscopie RAMAN la résolution utilisée est de l’ordre du micromètre alors que la JDE
mesure environ 100 nm. De nouvelles études, basées sur la spectroscopie à champ proche,
dont la résolution est de l'ordre du nanomètre, sont actuellement en cours. Elles permettront
d’analyser spécifiquement la jonction dermo-épidermique.
Les kératinocytes et les fibroblastes dermiques sont les 2 types cellulaires majeurs participant
au dépôt de collagène IV au niveau de la jonction dermo-épidermique. Par manque de temps
E. Discussion
149
et pour des raisons techniques, nous avons choisi de nous consacrer à l’étude de l’expression
protéique du collagène IV par les fibroblastes dermiques humains uniquement.
Nous avons étudié l’expression des six chaînes constitutives du collagène de type IV par des
fibroblastes dermiques en culture, provenant de patients d’âge croissant. Au niveau de la JDE,
les chaînes 1 et 2(IV) sont largement exprimées (Abreu-Velez et Howard, 2012), les
chaînes 5 et 6(IV) sont faiblement exprimées et les chaînes 3 et 4(IV) ne sont pas
exprimées (Hasegawa et coll, 2007).
Cette étude a d’abord été réalisée à partir de fibroblastes issus de prépuces et de seins afin
d’avoir un panel important de patients d’âges différents et donc des résultats statistiquement
significatifs. En accord avec les résultats publiés dans la littérature, nous n’avons pu mettre en
évidence l’expression des chaînes 3(IV) et 4(IV). L’expression génique des chaînes 5 et
6(IV) a également été étudiée ; cependant, du fait de la très faible expression de ces chaînes
par les fibroblastes dermiques, l’efficacité des réactions PCR était inferieure à 90%. Les
résultats n’ont donc pas pu être validés bien qu’une tendance à la diminution de l’expression
de ces deux chaînes ait été observée en fonction de l’âge.Pour les chaînes 1 et 2(IV), nous
avons montré une diminution importante d’ expression après 10 ans, se poursuivant jusqu’à
40 ans et se stabilisant ensuite. Il est important de noter que l’expression génique des chaînes
1 et 2(IV) évolue de façon identique au cours du vieillissement ; ceci peut s’expliquer par
le fait que leurs deux gènes sont localisés tête-bêche sur le même chromosome et qu’ils sont
sous le contrôle d'un promoteur commun (Khoshnoodi et coll, 2008). Afin de s’affranchir des
différences d’expression dépendantes des tissus, nous avons étudié l’expression génique des
chaînes de collagène IV par les fibroblastes issus de prépuces d’une part, et de seins d’autre
part. Pour les fibroblastes issus de prépuces, une tendance à la diminution d’expression de la
chaîne 1(IV) entre 1 et 12 ans a été mise en évidence mais les très grandes variabilités
interindividuelles ne nous ont pas permis d’obtenir un résultat statistiquement significatif. De
plus, les circoncisions sont généralement réalisées sur de jeunes enfants et nous n’avons
obtenu que peu de prépuces pour les tranches d’âges supérieures à 5 ans. Pour les fibroblastes
issus de fragments de seins, nous avons également mis en évidence une diminution
d’expression de la chaîne 1(IV), et cette diminution est significative entre les groupe 30-40
et le groupe 51-60 ans. Cependant les variations interindividuelles sont très importantes. Nous
avons confirmé cette diminution d’expression du collagène IV au niveau protéique par dosage
ELISA mais les résultats sont à prendre avec précaution dans la mesure où l’étude n’a été
réalisée que sur 4 échantillons. Cette étude semble toutefois confirmer les résultats de
E. Discussion
150
Vazquez montrant que le collagène de type IV de la jonction dermo-épidermique diminue au
cours du vieillissement. Cette diminution semble due, au moins en partie, à la diminution
d’expression génique du collagène IV par les fibroblastes dermiques avec l’âge.
Les variations interindividuelles étant considérables chez l’homme, nous avons d’abord pensé
à utiliser un modèle murin, modèle très utilisé du fait du faible coût des souris, de leur vitesse
de vieillissement et du fait que la plupart de leur gènes sont connus et retrouvés chez
l’humain. En collaboration avec Romain Debret de l’IBCP de Lyon, nous avons étudié
l’expression des chaînes 1, 2, 5 et 6 présentes au niveau de la JDE. Pour les fibroblastes
dermiques murins, une diminution d’expression des chaines 1 et 2(IV) est observée chez
les souris âgées par rapport aux souris jeunes, laissant penser que ces souris pourraient
constituer un bon modèle d’étude de la diminution de collagène IV au cours du vieillissement.
Cependant, quand nous avons étudié l’expression génique des chaînes 5 et 6(IV), nous
avons constaté une forte augmentation de ces chaînes, contrairement au modèle humain où les
différences n’étaient pas significatives mais tendaient tout de même vers une diminution
d’expression. L’augmentation d’expression des chaînes 5 et 6(IV) semblent compenser la
diminution d’expression des chaînes 1 et 2(IV). Un tel phénomène compensatoire a déjà
été observé dans d’autres conditions physiopathologiques, par exemple au cours du
développement embryonnaire, lorsque le trimère ubiquitaire 112(IV) est remplacé de
façon tissu spécifique et stade de développement spécifique par les autres isoformes dits
« minoritaires » (Poschl et coll, 2004). Par ailleurs, les souris KO pour 3(IV) présentent un
niveau d’ARNm pour 1 et 2 plus élevé que les souris sauvages au niveau de la membrane
basale glomérulaire (Miner et Sanes, 1996).
Toujours en collaboration avec Romain Debret, nous avons étudié l’expression de collagène
IV dans un modèle de souris présentant une sénescence prématurée. Les souris SAM sont
obtenues par croisements consanguins continus entre frères et soeurs à partir de 5 lignées
sources originales ARK présentant une sénescence accélérée (SAMP, senescenceprone) et de
3 lignées de souris ARK présentant un vieillissement normal (SAMR, senescenceresistant)
(Takeda et coll, 1981). Les chaînes 1 et 2(IV) ne varient pas dans ce modèle de
viellissement, ce qui fait que ce type de souris ne constituent pas un bon modèle d’étude. Ces
souris sont plus adaptées à l’étude de pathologies cérébrales.
Nous avons donc recherché un modèle d’étude sur fibroblastes humains. Nous avons tout
d’abord pensé à un modèle de vieillissement par passages successifs car il est le plus
representatif du vieillissement naturel étant donné qu’à chaque passage il y a une perte
E. Discussion
151
progressive des extrémités télomériques (Funk et coll, 2000). Nous avons montré que la
sénescence est bien induite à passage 10 : l’augmentation de p21WAF-1 et de gènes
caractéristiques des cellules sénescentes. Le fait que p53 ne présente pas de variation
significative s’explique par le fait que lors de l’induction de la sénescence, c’est son activation
et/ou son augmentation d’expression protéique qui provoque l’induction d’expression de
p21WAF-1 (Furukawa et coll, 2007), et non pas son augmentation d’expression génique (Kim et
coll, 2002). De plus il a été montré que p21WAF-1 pouvait être augmenté de façon indépendante
de p53 mais le mécanisme est encore à ce jour inconnu (Chen, 2000). Nous avons également
vérifié que des gènes de protéines matricielles variaient lors de l’induction de la sénescence.
En effet, lors d’un vieillissement chronologique, l’expression génique du collagène I et de la
MMP-1 sont décrits dans la littérature comme diminuant (Uitto, 2008) et augmentant (Xia et
coll, 2013) respectivement. Dans ce modèle nous n’avons pas montré d’augmentation de
l’expression génique de MMPs. Nous avons étudié l’expression de gènes associés à la
sénescence tels que l’apoprotéines J, la smooth muscle 22 (SM22), l’ostéonectine et la
fibronectine décrits pour augmenter au cours du vieillissement (Gonos et coll, 1998). Nous
retrouvons ces augmentations dans notre modèle. Nous avons ensuite montré qu’au niveau
génique, le collagène IV suivait la même évolution que lors d’un vieillissement
chronologique, cependant au niveau protéique aucune variation significative entre p4 et p10
n’a pu être mise en évidence.
Nous avons alors décidé de mettre au point un modèle de sénescence induite par un stress
(SIPS: stress induced premature senescence) en traitant les fibroblastes avec de l’H2O2 (Wang
et coll, 2013) ou avec du NaCl (Dmitrieva et Burg, 2007).
Nous avons traité les fibroblastes au peroxyde d’hydrogène avec des doses allant de 50 à 200
µM pendant 1h30 et avons déterminé la dose subtoxique en mesurant la viabilité à l’aide du
bleu trypan. Les fibroblastes traités avec 100 µM d’H2O2 ne présentent pas de mort cellulaire
alors que les doses plus élevées ont des effets différents en fonction des fibroblastes testés.
Certains ne présentent pas de mort cellulaire alors que pour d’autres une diminution de 40%
de la viabilité est observée. Comme nous voulons faire un modèle de vieillissement unique
pour tous les fibroblastes nous avons choisi d’utiliser la dose de 100 µM.
Pour les fibroblastes traités avec 200 à 300 mM de chlorure de sodium, nous avons
sélectionné la dose de 225 mM puisqu’au-delà les fibroblastes réagissent également assez
différemment.
E. Discussion
152
Pour vérifier que la sénescence a bien été induite avec les traitements aux doses subtoxiques
d’ H2O2 et de NaCl, nous avons d’abord observé le changement de morphologie des cellules.
Les fibroblastes traités avec 100 µM d’ H2O2 d’une part et ceux traités 225 mM de NaCl
présentent bien la morphologie caractéristique des cellules sénescentes. D’un point de vue
morphologique, la sénescence semble donc être induite avec les doses d’H2O2 et de NaCl
sélectionnées. Nous avons ensuite observé l’activité SA--galactosidase des cellules traitées
et, pour les deux traitements, il y a une augmentation de son activité. Cependant, loin d’être
directement corrélée au processus de sénescence, la spécificité du test SA-β-Gal a été
plusieurs fois remise en cause (Severino, Allen et al. 2000; Yang and Hu 2005). En effet, un
marquage positif a été observé par exemple lorsque des fibroblastes ont été maintenus en
culture avec une faible concentration de sérum, ou après une longue période à confluence. Or,
nous avons privé les cellules de sérum pendant 48h, ce qui pourrait avoir induit des faux
positifs. Nous avons donc cherché à mettre en évidence l’induction de la senescence par étude
de l’expression de gènes impliqués dans l’arret du cycle cellulaire tels que p21WAF-1 et p53
(Chen, 200). Les fibroblastes traités avec 100 µM d’H2O2 présentent une augmentation
d’expression de p21WAF-1 et aucune variation significative de l’expression de p53. Comme
expliqué précédemment pour le modèle de vieillissement par passages successifs, il semble
que c’est son activation et/ou son augmentation d’expression protéique qui provoque
l’induction d’expression de p21WAF-1. Les fibroblastes traités avec 225 mM de NaCl ne
présentent pas de variation d’expression de p21WAF-1 et de p53. Cela peut s’expliquer par le
fait que la sénescence induite par NaCl passe par une voie indépendante de la voie p16INK-4a
(Dmitrieva et Burg, 2007). Nous avons vérifié que les gènes des protéines matricielles,
collagène I et MMP-1, variaient bien comme lors d’un vieillissement chronologique. Nous
avons donc montré que le traitement avec 100 µM d’H2O2 et celui avec 225 mM de NaCl ont
induit la sénescence prématurée des fibroblastes dermiques. Comme pour les autres modèles,
l’étape suivante était de vérifier que l’expression du collagène IV suivait bien la même
évolution que lors d’un vieillissement chronologique. Pour les deux traitements, l’expression
génique des chaînes 1 et 2(IV) diminuent. Au niveau protéique, le traitement avec 225 mM
de NaCl n’a provoqué aucune variation d’expression du collagène IV. Ce modèle de
vieillissement accéléré des fibroblastes ne peut donc pas être validé et utilisé pour l’étude de
la variation du collagène IV au cours du temps. Ces résultats sont semblables au modèle de
vieillissement par passage successifs ou la diminution d’expression du collagène IV est bien
induite au niveau génique mais pas retrouvée au niveau protéique.
E. Discussion
153
Pour le vieillissement induit par H2O2, la diminution d’expression du collagène IV est
également retrouvée au niveau protéique. Nous avons vérifié ces variations d’expressions
protéique par dosage ELISA.
Le modèle de vieillissement induit par H2O2 est donc validé et sera utilisé pour étudier les
mécanismes conduisant à la variation du collagène IV au cours du temps.
Dans la seconde partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés à différents facteurs
pouvant moduler l’expression de collagène IV. Une étude a été réalisée au sein du laboratoire
par Etienne Delobbe, qui a testé l’effet de 3 cytokines sur la synthèse de collagène IV par les
fibroblastes dermiques humains contrôles. Ces effecteurs sont le TGF-ß1, et le CTGF, connus
pour augmenter l’expression de différents types de collagènes dans divers types cellulaires
(Bettinger et coll, 1996 ; Oliver et coll, 2010), ainsi que l’IL-1ß, connu pour diminuer
l’expression de la chaîne 1(I) (Siwik et coll, 2000). Le CTGF n’induit pas de modification
de l’expression du collagène IV, l’IL-1ß induit une faible augmentation et le TGF-ß1 est celui
qui augmente le plus significativement la synthèse de collagène IV, tant au niveau
transcriptionnel que traductionnel. Ce résultat est en accord avec plusieurs études qui ont
montré que le TGF-ß1 stimulait la synthèse de collagène IV dans certains types cellulaires
comme les fibroblastes embryonnaires murins NIH-3T3 où il induit l’expression génique des
chaînes 1 et 2(IV) (Grande et coll, 1993), mais également dans les cellules mésangiales
murines (Jiang et coll, 2010; Leil et coll, 1998).
De plus, il est maintenant bien établi que le TGF-augmente la synthèse de collagène I et que
sa diminution d’activité est aussi impliquée dans la diminution de ce collagène au cours du
vieillissement (Quan et coll, 2004). Suite à cette première expérience et à ces constatations,
nous avons décidé de nous focaliser sur le TGF-ß1. L’utilisation d’anticorps bloquants du
TGF-nous a permis de mettre en évidence une diminution de la synthèse de collagène IV
lorsque la voie du TGF-est inactivée. Nous avons étudié l’expression du collagène IV
dans notre modèle de vieillissement, en présence ou en absence de TGF-1. Nous avons traité
les fibroblastes présentant un phénotype sénescent avec le TGF- 1 afin de vérifier qu’il était
toujours capable de stimuler la synthèse de collagène IV dans ces conditions et de restaurer le
taux basal d’expression.
Dans une troisième partie, nous nous sommes intéressés aux mécanismes d’action
conduisant à la diminution de collagène de type IV. Nous avons, à l’aide de « protein array »,
étudié l’expression de protéines impliquées dans la voie du TGF-dans des fibroblastes
témoins et des fibroblastes sénescents (traités avec 100 µM d’H2O2) et avons mis en évidence
E. Discussion
154
une diminution d’expression du récepteur au TGF-leTRII, ainsi que, de façon moins
importante, une diminution d’expression du TGF-Nous avons également observé une
augmentation de phospho-Smad 2 et 3. Une augmentation de JNK et p38MAPK est
également observée. Ces protéines sont impliquées dans la diminution d’expression de
procollagène I par les fibroblastes dermiques lors d’un stress induit par les UVs (Rittier et
Fisher, 2002). Il est possible que ces molécules jouent également un rôle dans la diminution
de la synthèse de collagène IV. Des modulations d’expression (positives telles que pour la
MAP kinase kinase 6, la protéine kinase C theta, AKT1, ou négatives telles que pour la PKC
zeta) ou de phosphorylations (positives telles que pour JNK, AKT1 ou négatives telles que
pour Myc) ont été également mises en évidence. Une des perspectives est d’étudier l’effet
d’une inhibition ou d’une surexpression de l’expression ou de la phoshorylation de ces
protéines sur la synthèse de collagène IV par les fibroblastes dermiques sénescents. L’étude
de l’expression génique du TGF- et de son récepteur TRII a révélé que le TGF-1 ne
variait pas dans des fibroblastes sénescents comparé à des fibroblastes contrôle tandis que son
récepteur diminuait. Le fait que l’ARNm du TGF-ne varie pas est en corrélation avec une
étude réalisée en 1996 montrant que c’est n’est pas le niveau basal de TGF-qui est modifié
au cours du vieillissement mais son activité (Zeng et coll, 1996). De plus, il a également été
montré que lors d’un vieillissement dû aux UV, c’est l’expression génique du récepteur qui
diminue mais pas celle du TGF-1 lorsque les cellules étaient exposées aux UV (Han et coll,
2004). Nous avons tout de même étudié l’expression protéique de TGF- après traitement en
réalisant une cinétique allant de 0 à 48 h et nous avons montré une diminution de TGF-2h
après le traitement se prolongeant jusqu’entre 24 et 48 h.
Pour vérifier que la voie des Smads est bien impliquée dans la synthèse de collagène IV, nous
avons réalisé des immunoprécipitations des phospho-Smad 2 et 3 à partir d’extraits cellulaires
de fibroblastes traités ou non avec 100 µM d’H2O2 avons montré une légère augmentation de
la phosporylation de Smad 2 et 3 à chez les fibroblastes sénescents par rapport aux
fibroblastes témoins, ce qui est semble confirmer les résultats observés par « protein array ».
Nous continuons actuellement cette étude réalisant une cinétique allant de 0 à 48 h sur des
fibroblastes traités avec 100 µM d’H2O2 afin de confirmer l’augmentation de phosphorylation
mais aussi de detèrminer combien de temps après le traitement avec H2O2 cette augmentation
débute.
Les résultats de cette étude suggérent que la diminution d’expression de collagène IV dans les
membranes basales âgées, pourrait être, en partie, due à la diminution d’expression de
E. Discussion
155
collagène IV par les fibroblastes dermiques sénescents puisqu’il a été rapporté qu’une
accumulation de fibroblastes sénescentes est observée avec l’age in vivo (Dimri et coll, 1995).
156
F. Conclusion et perspective
F. Conclusion et perspectives
157
Nous avons démontré que l’expression protéique des chaînes 1 et 2(IV) dans des
extraits de peaux totales tend à diminuer au cours du vieillissement. Cependant nous n’avons
pas pu différencier le collagène IV de la jonction dermo-épidermique de celui présent dans les
vaisseaux sanguins du derme. Nous avons, pour pallier à ce problème, réalisé des
microdissections lasers afin de ne récupérer que la JDE mais la très faible quantité de
protéines obtenus du fait de la faible épaisseur de la JDE ne nous a pas permis de mettre au
point un western-blot assez sensible pour détecter le collagène de type IV.
Nous n’avons pu réaliser l’étude de l’expression génique de ces chaînes puisque nous
n’avons extrait que des ARN dégradés du fait du temps écoulé entre la collecte des fragments
de peaux au bloc opératoire et le moment où nous récupérons ces fragments. Une perspective
est de pouvoir récupérer les fragments de peau directement à la sortie du bloc opératoire afin
d’extraire les ARN le plus rapidement possible et ainsi éviter leur dégradation.
Pour l’expression génique de la chaîne 1(IV) par les fibroblastes dermiques, nous
avons montré une diminution d’expression de cette chaîne au cours du vieillissement dans des
fibroblastes issus de prépuces et de seins. Mais du fait de l’origine différente des fragments de
peaux nous avons ensuite préféré réaliser deux études distinctes, l’une sur les fibroblastes de
prépuces, l’autre sur ceux de seins. Mais les prépuces de patients âgés sont très rares. Les
fragments de peau prélevés à distance des tumeurs mammaires sont aussi très rares chez les
sujets jeunes. Il faudrait idéalement prélever un fragment de peau à une localisation accessible
chez des patients de tous âges.
De plus, par manque de temps, nous n’avons pu étudier l’expression de collagène IV
par les kératinocytes. Des études préliminaires réalisées sur kératinocytes issus de prépuces et
de seins avaient mis en évidence une diminution d’expression des 4 chaînes présentent dans la
JDE. Cependant du fait de la provenance différente des kératinocytes, nous n’avons pas validé
ce résultat. Il serait donc intéressant d’étudier les variations d’expressions du collagène IV
soit dans des kératinocytes provenant d’une même origine mais chez des patients d’âges
différents, soit, pour s’affranchir des variations interindividuelles, induire un vieillissement
prématuré des kératinocytes par traitement aux UVs (Debacq-Chainiaux et coll, 2012).
La mise au point d’un modèle pour étudier le mécanisme impliqué dans la diminution
de collagène IV lors du vieillissement nous a permis de nous affranchir des importantes
variations interindividuelles. Le modèle murin n’est pas adapté à l’étude des variations de
collagène IV au cours du temps puisqu’il semble y avoir un phénomène compensatoire de la
F. Conclusion et perspectives
158
diminution d’expression d’1 et 2(IV) par 5 et 6(IV) qui n’est pas observé chez
l’humain. Les souris SAM ne présentent également pas un modèle d’étude adapté puisque les
chaînes 1 et 2(IV) ne varient pas entre les souris vieillies artificiellement et les souris
témoins.
Le modèle de vieillissement par passages et par traitement au NaCl n’ont pas pu être
utilisés non plus bien que l’expression génique des chaînes 1 et 2(IV) suive la même
évolution que lors d’un vieillissement chronologique, aucune variation de l’expression
protéique n’est observée. Cependant ces modèles peuvent être utilisés pour étudier la
régulation de l’expression génique de ces chaînes au cours du vieillissement. En effet, la
diminution génique d’1 et 2(IV) semble corrélée, ce qui n’est pas surprenant compte tenu
du fait que ces deux gènes sont sous le contrôle d’un promoteur commun. Ce promoteur
possède des sites de fixation et est régulé par le facteur sp1 (boîte GC et boîte CTC), le
CCAAT-binding factor et le CTC-binding factor. Une des perspectives est d’étudier les
potentielles variations d’expression de ces facteurs de transcription par les fibroblastes vieillis
artificiellement par rapport aux fibroblastes témoins.
Le modèle de vieillissement par traitement avec H2O2 représente un modèle adapté pour notre
étude puisqu’il suit les variations géniques et protéiques du collagène IV au cours d’un
vieillissement chronologique.
Nous avons montré que le TGF-1 induisait la synthèse de collagène IV par les fibroblastes
dermiques contrôles. De plus une inhibition du TGF-1 par un anticorps bloquant inhibe la
synthèse de collagène IV par les fibroblastes dermiques. Dans les fibroblastes sénescents
(vieillis artificiellement par H2O2) un traitement au TGF-1 est capable de restaurer
l’expression de collagène IV.
L’expression de plusieurs protéines de la voie du TGF-1 est modifiée lorsque les cellules
sont sénescentes. Une des perspectives est donc de voir si ces modifications d’expression et
de phosphorylation des protéines de la voie du TGF-1 sont liées avec la baisse d’expression
de collagène IV. Ce qui permettrait, à terme, de cibler les protéines en amont de cette voie de
signalisation et de moduler leur expression afin de restaurer le collagène de type IV des
fibroblastes âgés ou de contrer sa diminution au cours du vieillissement.
Les perspectives à long terme de cette étude sont donc de déterminer le mécanisme
exact à l’origine de cette diminution de collagène IV au niveau de la jonction dermo-
épidermique dans le but de proposer, à terme des solutions permettant de rétablir son
F. Conclusion et perspectives
159
expression afin de maintenir l’intégrité de la membrane basale dermo-épidermique au cours
du vieillissement.
De plus, les domaines non collagéniques NC1 possèdent des propriétés anti-
angiogéniques et/ou anti-tumorales importantes. Le maintien de l’expression de ce collagène
de type IV pourrait donc permettre de s’opposer au développement de cancers cutanés chez
les personnes âgées.
160
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RESUME
Titre : Etude de la diminution du collagène IV au cours du vieillissement cutané et des mécanismes impliqués Le vieillissement cutané s’accompagne d’altérations des composants de la matrice extracellulaire. Des études ont montré que le contenu en collagène IV diminuait dans la peau à partir de 35 ans. Le collagène IV, constituant majeur des membranes basales, est formé de l’association, en triple hélice, de 3 chaînes parmi 6 possibles: 1(IV) à 6(IV). Au niveau de la membrane basale cutanée, encore appelée jonction dermo-épidermique, seulement deux isoformes de collagène IV ont été mises en évidence : [1(IV)2; 2(IV)], isoforme majoritaire, et [5(IV)2; 6(IV)], isoforme minoritaire, synthétisées par les fibroblastes et les kératinocytes. Nous avons vérifié, par western-blot sur des extraits de peaux, cette diminution de collagène IV. Nous avons ensuite analysé la répartition du collagène IV au niveau de la JDE sur des coupes transversales de peau et n’avons pu mettre en évidence de discontinuité dans le réseau de collagène IV avec l’âge, du fait des fortes variations inter-individuelles. Parallèlement, sur coupe de peau, nous avons tenté de mettre en évidence des différences spectrales du collagène IV avec l’âge par spectroscopie Raman mais la résolution s’est avérée insuffisante. Nous avons isolé des fibroblastes de patients d’âges différents et montré une diminution de l’expression génique de la chaîne 1(IV) malgré de fortes variations inter-individuelles. Afin de s’affranchir de ces variations inter-individuelles pour étudier les mécanismes impliqués dans la diminution d’expression du collagène IV, nous avons mis au point un modèle de vieillissement accéléré de fibroblastes traités à l’H2O2 et vérifié le phénotype sénescent des cellules (morphologie modifiée, augmentation de l’activité SA--galactosidase, augmentation de p21WAF-1…). Nous nous sommes interessé à la voie du TGF-1. Nous avons montré que l’expression du récepteur au TGF-1, TRII, diminuait dans le modèle de vieillissement accéléré. Nous avons également montré qu’un anticorps bloquant anti-TGF-1 reproduisait la diminution d’expression de collagène IV observée au cours de la sénescence. La détermination du mécanisme impliqué pourrait permettre, à terme, de proposer de nouvelles stratégies pour maintenir l’intégrité de la membrane basale lors du vieillissement cutané. Mots clés : collagène de type IV, vieillissement cutanée, fibroblastes dermiques, sénescence, TGF-ß1
ABSTRACT
Title: Study of type IV collagen decrease during skin aging and involves mechanisms During aging skin there are extracellular matrix alterations. Preliminary studies showed that type IV collagen content decreased in skin with age after 35 years. Type IV collagen is a major component of basement membranes. It’s constituted by the association of 3 alpha chains among 6 possible (1 to 6). In the cutaneous basement membrane also called dermo-epidermal junction, only two isoform of type IV collagen were found: [1(IV)2; 2(IV)], which is majoritary isoform, and [5(IV)2; 6(IV)], which is minoritary, both synthesized by fibroblasts and keratinocytes. We checked the decrease in type IV collagen by western-blot on skin extracts. We then analyzed the distribution of this collagen in the DEJ on skin sections but we were not able to highlight a discontinuity in the network of type IV collagen during aging. At the same time, we tried to highlight spectral differences of the collagen IV with aging by Raman spectroscopy on skin sections but the resolution was insufficient. 35 years. We showed a decrease of type IV collagen expression by dermal fibroblasts in spite of strong variation between patients. In order to study the mechanism involved in type IV collagen variation during aging in dermal fibroblasts avoiding inter-individual variations, we develop an accelerated aging model of fibroblasts by treatment with H2O2. We checked the senescent phenotype of the cells (modified morphology, increase of SA--galactosidase activity, increase of p21WAF-1…). We were interested on the TGF-1 pathway and we showed that TGF-1 receptor, called TRII, was decreased in our accelerated aging model. We also showed that a blocking antibody against TGF-1 reproduced the decrease of type IV collagen expression observed during the senescence. during aging. The determination of the involved mechanism could lead to propose new strategies to maintain the integrity of the basal membrane during skin aging.
Keywords : IV collagen, skin aging, dermal fibroblasts, senescence, TGF-ß1
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